Tek benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskobik kaplin analizi, büyüme konisi ilerlemesi ve navigasyonu için moleküler makineleri analiz edebilir. Teknikler ticari olarak mevcut malzemeleri ve standart mikroskopları kullandığından. Araştırmacılar çalışmalarındaki tekniklere kelimenin tam anlamıyla uyum sağlayabilirler.
Nöronları tetrametril-rhodamin veya TMR ligand ile tedavi ederek başlayın ve in vitro 3'ün olduğu gün kültür ortamında 1 ila 2000 arasında bir seyreltmede. Daha sonra nöronları bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede koruyun. Kuluçkadan sonra, TMR ligandını önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın.
Nöronlara 0,5 mililitre ısıtılmış Leibovitz'in L-15 ortamını eklemeden önce PBS'yi çıkarın. Nöronları bir saat boyunca 37 santigrat derecede koruyun. Ardından, bir epifluoresans mikroskobu açın ve durum üst inkübatörü 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Daha sonra TMR ligand tedavi nöronlarını ısıtılmış sahne üst inkübatörüne cam alt tabağa yerleştirin. Lifeact ve HaloTag-actin floresan kanalları için pozlama süresi gibi görüntü alma parametrelerini 50 kare olarak ayarlayın ve 50 kare için üç saniyelik zaman aralığında piksel başına 0,065 mikron ile 0,065 mikron olarak binning. Lifeact'i güçlü bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçtikten sonra ve haftalık HaloTag-actin'i ifade eder.
Büyüme konisini içeren minimum alanı aydınlatmak ve zaman atlamalı görüntüler elde etmek için diyaframdaki alanı kapatın. In vitro 3 gününde, kültür ortamını 0,5 mililitre ısıtılmış Leibovitz'in L-15 ortamıyla değiştirin ve nöronları 37 santigrat derecede bir saat koruyun. Çekiş kuvveti mikroskopisi için lazer tarama konfokal mikroskobu açın ve sahne üst inkübatörü 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Nöronları önceden uyarılmış sahne üst inkübatöründeki cam alt kabın üzerine yerleştirin. Menü komut dosyasında açıklandığı gibi görüntü alma parametrelerini ayarlayın ve gelişmiş yeşil floresan proteinini veya EGFP'yi güçlü bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçin. Jel yüzeye odaklanın ve hızlandırılmış görüntüler elde edin.
Bittiğinde, tek kanallı zaman atlamalı RGB görüntü yığınları üretmek için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Ardından görüntüleri tiff dosyaları olarak kaydedin. Daha sonra, nöronları substrattan serbest bırakarak jel substratını gevşetmek için cam alt kabına, damıtılmış suda çözünmüş hacim sodyum dodecyl sülfat veya SDS ile% 10 ağırlıkta 100 mikrolitre uygulayın.
Daha sonra sıcaklığı stabilize etmek için kabı sahne üst inkübatöründe 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Lazer tarama konfokal mikroskopunda, kısıtlanmamış substrattaki boncukların görüntüsünü elde etmek için jel yüzeyine odaklanın. Sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncukların tek kanallı RGB görüntüsünü üretin ve bu görüntüyü bir tiff dosyası olarak kaydedin.
Çekiş kuvveti analiz kodunu indirin TFM2021 ve MATLAB'da TFM2021'i açın. Ana kapıyı açın. m TFM2021'de ve çalıştırın.
Ekranda grafik kullanıcı arabirimi göründüğünde. Eğitimsiz, substrat görüntüsünü yükleyin ve kısıtlanılmamış alt tabakada X-Y konumu düzeltilmiş boncuk görüntüsünü seçin. Floresan boncuk görüntülerini yüklemek için gidin ve görüntü boncuklarının zaman atlamalı yığınını seçin.
Ardından, parlak alanın zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçmek için parlak alan görüntülerini yükle'ye tıklayın ve EGFP'nin zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçmek için yük GFP görüntülerini kullanın. Grafik kullanıcı arabirimindeki açılan listeden, görüntülenen hücre görüntüsünde iki noktayı tıklatarak büyüme konisi de dahil olmak üzere ilgi çekici dikdörtgen bölgeyi belirtmek için yatırım getirisini tıklatmadan önce GFP'yi seçin. Tamamlandığında, seçilen yığın görüntülerini bir mat dosyasında yatırım getirisi ile birlikte kaydetmek için grafik kullanıcı arabirimindeki kaydet düğmesine tıklayın.
Ardından, yerinde algıla'ya tıklayın ve boncuk algılama eşiğini belirlemek için diyalog kutusuna istediğiniz değeri girin. Hesaplamaya başlamak için Tamam'a bas. Hesaplamayı bitirdikten sonra, daha önce seçilen bölgeyi büyütmek ve algılanan boncukları beyaz noktalar olarak görüntülemek için çizim parçasına tıklayın.
Büyüme konisinin altındaki doğru noktaları içeren çokgen bir bölgeyi sınırlandırmak için seçilmiş boncukları kullanın. Daha sonra klavyeye enter tuşuna basarak, çokgen bölgedeki beyaz noktalar kırmızıya dönüşür. Grafik kullanıcı arabiriminde tahmin kuvveti üzerine tıklayın.
Daha sonra piksel boyutu ve Young'ın modülü için giriş değerleri yazıda açıklandığı gibi. Poisson'un oranının değerini 0,3 olarak koyun ve hesaplamayı başlatmak için tahmin kuvveti yürütün. Yazılım, hesaplama sonuçlarını elektronik tablo biçimli bir dosyaya kaydeder.
Bir nöronal büyüme konisinin floresan görüntüleri, tamamen açık ve dar bir diyafram altında büyüme konisi morfolojisinin görselleştirilmesine izin veren yüksek bir Lifeact ifadesi gösterdi. HaloTag-actin ekspresyon seviyeleri loş sinyallerle çok düşüktü. Diyafram uygun şekilde daraltıldığında, arka plan sinyalleri azalır ve büyüme konisinde beneklerde tek bir hareket görülür.
Tüm adımları uygun şekilde başaran araştırmacılar, büyüme konisinde F-actin retrograd akışını gözlemleyecektir. Poliakrilamid jelin sertliği, mikrosferin ağırlığından kaynaklanan girinti derinliği hesaplanarak belirlendi. Jel yüzeyinin ve mikrosferin tabanının görüntülerini yakalamak için lazer tarama konfokal mikroskobu kullanıldı.
Floresan boncuklardan gelen sinyaller girintili bölgedeki jel yüzeyinde görünmüyordu. Poliakrilamid jel ve nöral büyüme koni içine gömülü boncukların floresan görüntüleri, boncukların kökenlerini ve yer değiştirmiş konumlarını gösterdi. Büyüme konisinin EGFP sinyali de gözlendi.
Kimograflar, bir referans boncukla karşılaştırıldığında boncuk hareketlerini gösterdi. Tek bir benek görüntüleme yaparken, haftalık olarak minimum iki alanın altında nasıl hareket gerektiğini ifade eden bir nöron seçmek için önemli şeyler. Bir çekiş kuvveti mikroskopisi yapılırken, yüksek büyütme görüntüleme, çekiş kuvvetinin doğru konsantrasyonu için önemlidir.
