Canlı hücre kalsiyum görüntüleme ile kombinasyon halinde, akut pankreas dokusu dilimleme tekniği, hücreler arası dalgaların ve çok hücreli fonksiyonel bağlantının uzun süreler boyunca yüksek çözünürlükte incelenmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajları, hızlı olması, doku mimarisini koruması ve yüksek doku verimini korurken sınırlı enzimatik ve mekanik stresi azaltmasıdır. Hastalığın ilerlemesi sırasında fonksiyonel ve morfolojik değişiklikleri tespit ederek, bu teknik diyabet gibi pankreasla ilgili hastalıkları anlamamıza yardımcı olur.
Bu doku dilimleme tekniği, hücreler arası temas, parakrin etkileşimler ve doku mimarisinin korunmasına vurgu yaparak beyin, hipofiz ve adrenal dokulara uygulanabilir. Agarozun fare pankreasına enjekte edilmesine hazırlanmak için, beş mililitrelik bir şırıngayı 40 santigrat derece sıvı agaroz ile doldurun ve şırıngayı 30 gauge iğne ile donatın. İğneyi dikkatlice bir kapakla kapattıktan sonra, şırınga iğnesinin ucunu, tüm agaroz hacmi su yüzeyinin altında, 40 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin.
Oksijenasyon ve 7.4 pH sağlamak için bir şişe hücre dışı çözeltiyi karbonhidrat ile, sürekli olarak buz üzerinde, barometrik basınçta ve oda sıcaklığında dakikada 1.5 mililitrede kabarcıklayın. Agaroz enjeksiyonunu gerçekleştirmek için stereo mikroskop altında ötenazi yetişkin bir fare yerleştirin ve laparotomi yoluyla fare karnına erişin. Ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için bağırsağı yavaşça sol tarafa hareket ettirin ve Vater'in papillasını bulmak için kanalın duodenal ucunu hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.
Agarozun kanaldan duodenuma sızmasını önlemek için duodenal papilladaki safra kanalını sıkıştırmak için bir hemostat kullanın ve kanalı pankreas dokusuna bağlayan zarı kırmak için ortak safra kanalının altına ulaşmak için küçük keskin bir forseps kullanın. Kanaldan mümkün olduğunca fazla yağ ve bağ dokusunu temizledikten sonra, kanalı dik olarak bir çift daha büyük forsederin uçlarına yerleştirin ve şırınga pistonuna sıkıca bastırın, viskoz sıvı agarozu ortak safra kanalının proksimal ucuna 20 ila 30 saniye boyunca enjekte edin. Doku beyazımsı hale geldiğinde ve hafifçe şiştiğinde, şırıngayı çıkarın ve dokuyu soğutmak ve agarozu sertleştirmek için pankreas üzerine kabarcıklı buz gibi soğuk hücre dışı çözeltinin 20 mililitresini yavaşça dökün.
Pankreas dokusu dilimleri elde etmek için, agaroz enjekte edilen pankreası 40 mililitre buz gibi soğuk hücre dışı çözelti içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına nazikçe aktarmak için forseps ve ince sert kesilmiş makas kullanın. Dokuyu durulamak için çanağı döndürün ve pankreası ikinci bir buz gibi soğuk hücre dışı çözelti kabına aktarın. Forseps ve makası kullanarak beyazımsı, iyi enjekte edilmiş pankreas bölümünü altı adet 0,1 ila 0,2 santimetreküp parçaya kadar kesin ve kalan bağ ve yağ dokusunu doku parçalarından çıkarın.
Temizlenmiş blokları, yaklaşık beş mililitre 40 santigrat derece sıvı agaroz içeren 35 milimetre yapışkan olmayan bir alt Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını hemen buzun üzerine yerleştirin. Agaroz sertleştiğinde, Petri kabını 100 milimetrelik bir Petri kabının kapağı üzerinde baş aşağı tutun ve agarozu tabaktan çıkarmak için Petri kabının yanal duvarı ile agaroz arasındaki kenar boşluğuna dikkatlice kesmek için bir tıraş bıçağının yarısını kullanın. Her biri bir doku bloğu agaroz içeren tek tek küpleri serbest bırakılmış agarozdan kesmek için tıraş bıçağını kullanın ve blokları bir vibratomun numune plakasına bağlamak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.
Vibratomun kesme odasını, sürekli olarak karbojenle kabarcıklanmış 150 mililitre buz gibi soğuk hücre dışı çözelti ile doldurun. Numune plakasını vibratomun üzerine vidalayın ve yeni bir tıraş bıçağı takın. Odayı buzla çevreleyin ve altı milimolar glikoz ile desteklenmiş hücre dışı çözelti ile yapılmış iki adet 10 mililitre hacimli buz küpü ekleyin.
Dilimleyiciyi saniyede 0,05 ila 1 milimetre ve 70 hertz'e ayarlayın, ardından 20 ila 100 milimetre kare yüzey alanına sahip 140 mikron kalınlığında agaroz dilimleri elde etmek için dilimlemeye başlayın. Her dilimi, altı milimolar glikozla desteklenmiş 40 milimetre HEPES tamponu ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir Petri kabına dikkatlice aktarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Kalsiyum boya hazırlığı için, 50 mikrogram hücre geçirgen kalsiyum gösterge boyası, 7.5 mikrolitre DMSO ve 2.5 mikrolitre poloksamer ve 6.667 mililitre HBS'yi 15 mililitrelik bir vidalı kapak tüpünde çözün.
Tüpü ultrasonik bir banyo odasına batırmadan ve her biri 30 saniye boyunca girdaba batırmadan önce çözeltiyi 20 saniye boyunca iyice karıştırmak için bir pipet kullanın. Daha sonra elde edilen kalsiyum indikatör boya çözeltisinin 3.333 mililitrelik aliquot'u, etiketlenecek 10 dilim doku başına bir 5 mililitre Petri kabına dönüştürür. Boya yüklemesi için, her bir boya çözeltisi kabına 10 adede kadar doku dilimi aktarmak için ince yumuşak bir boya fırçası kullanın ve bulaşıkları oda sıcaklığında 50 dakika ve ışıktan korunan dakikada 40 devir boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Kuluçkanın sonunda, boyasız HBS ile doldurulmuş bireysel 60 mililitrelik Petri kaplarına 20 adede kadar lekeli dilim aktarın. Konfokal mikroskopi ile kalsiyum görüntüleme için 20 veya 25 kat büyütme seçin ve edinme modunu hızlandırılmış görüntülemeye, iğne deliğini 100 ila 200 mikrona ve deneyde kullanılan florofor için uyarma ve emisyona ayarlayın. Kayıt odasını ve perfüzyon sistemini mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına monte edin ve giriş ve çıkışı kayıt odasının uzak kenarlarına yerleştirin.
Giriş ve çıkış hızlarını dakikada bir ila iki mililitreye ayarlayın. Profüzyon sisteminin sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve uyarıcı olmayan çözelti ile bolluğu başlatın. Dokunun kalsiyum dinamiklerini kaydetmek için kayıt odasına tek bir doku dilimi yerleştirin ve dokuyu gergin bir naylon ağ ile U şeklinde bir platin ağırlığı ile hareketsiz hale getirin.
İlgilenilen yapıyı bulmak için parlak alan seçeneğini kullanın ve incelenen yapıları görüş alanına konumlandırmak için canlı görüntülemeyi kullanın. Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, lazer gücünü, dedektör amplifikasyonunu ve çizgi ortalaması bağlamayı ayarlayarak lazer gücünü minimumda tutun. Potansiyel olarak hasar görmüş hücrelerden kayıt yapılmasını önlemek ve görüntüleri elde etmek için odak düzlemini kesme yüzeyinin 15 mikron altına ayarlayın.
Tek tek salınımların ilk algılanmasına izin vermek ve yüksek çözünürlüklü bir görüntü kaydetmek için örnekleme frekansını bir ila iki hertz'e ayarlamak. Varsa, hazırlık yanıtı, aşırı aydınlatma, fotobeyazlatma ve mekanik sapma hakkında anında geri bildirim almak için çevrimiçi bir grafik kullanın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, verileri daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.
Burada, hücre geçirgen kalsiyum gösterge boyasının pankreas dokusu dilimine başarıyla yüklendiği optimal bir doku dilimi örneği gözlemlenebilir. Buna karşılık, bu doku dilimleri, başarısız bir boya penetrasyonu, adacık hücrelerinin eksikliği veya numune yüzeyinde bol miktarda nekrotik doku nedeniyle görüntüleme için en uygun değildir. Bir pankreas dokusu diliminin yüksek çözünürlüklü görüntüleri, Langerhans adacıkları, asinar doku veya pankreas kanalı gibi pankreas dokusunun farklı bölgelerini tanımlamak için kullanılabilir.
Uyaranlar, farklı adacık hücreleri arasında veya adacık ve adacık olmayan hücreler arasında işlevsel olarak ayrım yapmak için kullanılabilir. Örneğin, beta hücreleri tipik olarak hücre içi kalsiyumda geçici bir artış göstererek kare darbeli glikoz stimülasyonuna yanıt verir ve ardından sürekli bir plato üzerinde hızlı bir kalsiyum salınımı gösterir. Buna karşılık, beta olmayan hücreler daha hızlı ve daha düzensiz salınımlarla yanıt verir.
Stimülasyondan sonra hücre içi kalsiyum artışının başlangıcındaki gecikmenin yanı sıra bireysel hücreler arasındaki heterojenlik ve gecikmeler de ölçülebilir. Aynı parametreler devre dışı bırakma aşamasını tanımlamak için de kullanılabilir. Burada hücre içi kalsiyum salınım süresinin, sıklığının ve aktif zaman yüzdesinin şematik bir sunumu gözlemlenebilir.
10 hertz'den daha yüksek edinme hızlarında görüntüleme yapıldığında, adacık boyunca tekrar tekrar yayılan kalsiyum dalgaları açıkça tanınabilir. Pankreasa giren dalın yanlışlıkla tıkanmasını önlemek için ortak safra kanalını duodenuma mümkün olduğunca yakın kelepçeleyin. Ayrıca, enjeksiyon sırasında pistonu bastırmayı bırakmayın, çünkü agaroz iğnede hemen sertleşir.
Akut fare pankreas dokusu dilimleme tekniği, iyon kanalı akımlarını incelemek ve sitoza erişmek için yama kelepçesi yöntemi ile immünohistokimya çalışmaları ve sekreter çalışmaları ile birlikte de kullanılabilir.
