Bu çalışma NIH (DC007681, AB), CT Kök Hücre hibe (AB), Pardee vakıf (AB), predoctoral Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülleri (NRSA) (SZY) ve NSF Lisansüstü Araştırma hibeleri ile desteklenen Bursu (BL). Biz el yazması üzerinde faydalı yorumları için Bordey laboratuar üyelerine teşekkür. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Devlet tarafından desteklenen çalışma dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut Devlet&#39;in resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Incorporated.

1. Çözümler, Diseksiyon ve Vibratome hazırlanması <ol><li> Çözümler Doğru osmolarite ve pH (Tablo 1) de hazır olmalıdır. Suni serebrospinal sıvı (ACSF) ile karşılaştırıldığında, diseksiyon çözeltisi, sodyum ve kalsiyum daha düşük konsantrasyonlarda, ve magnezyum daha yüksek konsantrasyonları ile hazırlanır. Bu dilimleme sırasında eksitotoksisite etkilerini en aza indirmektir. </li><li> Hem disseksiyon ve ACSF çözüm% 95 O2 /% 5 7.3, istenen pH değerinin elde edilmesi için, en azından 10 dakika için gazı ile CO2. Ile doygun hale getirilir </li><li> Bir tepsi içinde bir buz banyosu ile hazırlayın. Buz banyosunda bir diseksiyon plakası yerleştirin ve diseksiyon çözeltisi ile doldurun. Balon diseksiyonu plaka. </li><li> , Bir buz banyosu oluşturarak vibratome hazırlayın. Buz banyosu içinde kesit çanak yerleştirin, disseksiyon çözelti ve balon ile çanak doldurun. </li><li> Bu çözümü sağlamak için ACSF ve kabarcık ile oda tutarak dilim doldurun yeterince bağımsız havalandırılmaktadırdilimleri yerleştirilir nerede. </li></ol> 2. Beyin Dokusu giderimi Akut beyin dilimleri genç fareler ile sağlıklı olma eğilimindedirler. Kemirgenlerde postnatal SVZ hücresel mimarisi postnatal günde (P) 20 1 civarında olgun. Bu nedenle, P20-P30 fare yaşları bizim deneyler sınırlamak için deneyin ama biz 3 ay kadar eski farelerde başarılı deneyler yapmışlardır. Doku taşıma boyunca, bir, mekanik hareketleri ve beyne basınç minimize soğutmalı koşullarda muhafaza ve çözümü mümkün olduğu kadar çabuk şu kurban SVZ maruz dikkatli olmalıdır. <ol><li> Pentobarbital enjeksiyonundan sonra, fare hızla dekapite edilir. Kürk çıkarılır ve kesiler kafatası tabanı ile yapılır. Kafa sonra diseksiyon çözeltisi ile doldurulmuş bir tepsi içine yerleştirilir. </li><li> Forseps ile kafa stabilize ederken, sürekli kesik kafatası etrafında yapılır ve bazen Microsc ile orta hatta kadarissors. Doku ile temas en aza indirmek için dikkatli olun. Koku ampul SVZ gelen yenidoğan nöronların nihai hedef olduğundan, biri özellikle bu alanda çevresindeki kemik çıkarma işlemi sırasında, o bölgenin korunması dikkatli olmalıdır. Kafatasının çevresinde yapılan Microscissor kesim kafatası kolay çıkarılması için izin vermek için, dorsal tarafta olmalıdır. </li><li> Örten beyin kafatası çıkarılması hemen altında beyin kemik ayrılır. Önceki adımda kesintileri doğru yapılırsa, bu üstteki kemik cımbız veya forseps ile kolayca temizlenebilir. </li><li> Yine forseps ile kafa tutarken, bir temiz bir şekilde aşağıdakiler gibi, dilimleme önce beyin dokusu çeşitli parçaları ortadan kaldırmak için cerrahi bir bıçak kullanabilir. Koronal kesme lambda seviyesinde yapılabilir. Sagital kesim SVZ için yanal beynin her iki tarafına da yapılabilir. Bir tahminle orta hattan ~ 2,5 mm olacaktır. Eğer istenirse, beyin de burada hemisected edilebilir. Bu kesikler hem facil olacakdoku montaj itate ve beyin dilimleme SVZ daha hızlı bir şekilde ulaşılır izin verir. Bu beyin (örneğin itme veya çekme değil) mekanik güçlerin az miktarda uygulamak için hatırlamak önemlidir. </li></ol> 3. Akut Beyin Dilim Hazırlama <ol><li> , Sonraki adımlar için hazırlamak doku monte etmek için kullanılan süper yapıştırıcı takunya ücretsiz ve vibratome plaka uygulamak için hazır olduğundan emin olmak için. Beynin zarar vermeden mümkün olduğunca hızlı gitmek önemlidir. </li><li> Beyin dokusu daha sonra aynı anda sinirler ayıran temel dokuların kemikten ayırır altından gelen scooped edilebilir. </li><li> Doku ve monte edilmiş bir plaka üzerinde yapıştırılmış ve vibratome üzerinde yerleştirilir. SVZ ve rostral-kaudal anatomisi nedeniyle, biz nöroblast arasında göç yolu, glial kılıf ve büyük ölçüde bu yönde hizalanır damar korur gibi sagittal kesitler verme odaklanmıştır. Bir mo birini yapabilirsinizorta hattan veya SVZ lateral sagital kesimler tarafından oluşturulan düz bir yüzeye doku UNT. İsteğe bağlı adım dilimleri dökülmek olarak bıçak bir dayanak olarak hizmet dokusu arkasına% 3 agaroz blok yerleştirmektir. Biz tercihen siyanoakrilat tabanlı süper yapıştırıcı kullandı. </li><li> Yağlar kaldırmak ve damıtılmış su ile durulama ile etanol ile bıçak durulayın. Bıçak tutucu üzerindeki bıçağı yerleştirin. Vibratome için bıçak tutucu monte edin. </li><li> Dilim başına 250-350 mikron kalınlığında doku kesmek için vibratome ayarları yapın. Yüksek frekanslı titreşim ve düşük devir sayısı ile kesmek için önemlidir. </li><li> Giderek dokusu ile Bölüm. Koku ampul görünümü biri en lateral dilimleri ne bölge içerecek şekilde sagital dilimleri SVZ yakın olduğunu iyi bir göstergedir. Aramak için diğer yerlerinden ventrikül ve SVZ bulunduğu altındaki korpus kallosum, kalınlaşması içerir. SVZ daha lateral sagit ilk görünecektirtal dilimleri. RMS medial sagittal kesitler gösterecektir. </li><li> Ucu kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti ile SVZ içeren dilim çıkarın. Dilim tutma odasına aktarılması. Biz genellikle bir iş günü içinde kullanabileceğiniz daha dilimleri edinin. Bununla birlikte, dilimler SVZ içeren bir hücre miktarı değişecektir. Bu görüntüleme için istediğiniz birini bulmak için birkaç dilim bakmak bazen gereklidir. </li></ol> 4. Mikroskop ve Boyaların hazırlanması Dilimleri diseksiyonu ve dilimleme kurtarmak için ACSF içinde bir saatlik inkübasyon süresi gerektirir. Birkaç adım bu dilim iyileşme döneminde yapılabilir. <ol><li> Kalsiyum boya ve / veya ilaç uygulama için pipet hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Cam pipetler çap ve bir ucu uzunluğu (~ 2 mm) ve perfüzyon odası ile temasını önler açısı (~ 16 ° pipet tutucu için) 2-3 mikron bir ipucu olması gerekir ve yerleştirme için oda verirobjektif. </li><li> Bir tipik deney her gün için 6-8 basıncı pipetler hazırlayabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kalsiyum boya hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Çalışma çözeltisi (banyo ile 4-5 uM, 250 uM basınç uygulama tarafından) hazırlarken, bu hücrelere DMSO minimum miktarda maruz en iyisidir. Bu, yüksek derecede konsantre stok yaparak elde edilebilir. Örneğin, Fluo-4 için, 50 mg ihtiva eden bir tüp gün başına kullanılır. Bir DMSO içinde Pluronic F-127% 20 çözelti 4.6 ul ilave edilerek bu kısım bir 10 mM stok yapabilir. </li></ol></li><li> Mikroskop kurulumu (Şekil 2) hazırlanması. <ol class="lalpha"><li> Çözelti akışı için bir peristaltik bir pompa kullanımı görüntü kayma en aza yardımcı olmuştur. ACSF perfüzyon hatları üzerinden çalıştırmak ve kabarcık ücretsiz olmasını sağlamak için izin önce peristaltik pompa çalıştırın. </li><li> Perfüzyon odasının üzerindeki borusunun girişine ayarlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak. </li><li> Ens vakum ucu yerleştirinçözüm perfüzyon odasının aspire ediliyor ure. Bunun amacı uygun çalışma mesafe dalmış, ama böyle bu çözüm odasının üzerine dökmek olabilir çok yüksek değil, böylece yeterli düzeyde olduğundan emin olun. Çözüm düşük seviyede aynı zamanda akış bozulmaları en aza indirecektir. Bir sabit aspirasyon da istikrar için dinleyerek doğrulanabilir. </li></ol></li></ol> 5. Boya Yükleme Bu yöntem, bir el yazması 2&#39;de detaylı olarak tarif edilmiştir. Buradaki rakamlar bakın. <ol><li> Banyo yükleme boya <ol class="lalpha"><li> Boya bir 1-2 ml çalışma solüsyonu olun. AM Fluo-4 için, 4-5 uM bir konsantrasyonda SVZ nöroblast etiketleme için yeterli olmaktadır. </li><li> Dilimler birinci önceden ACSF ile dolu bir alt kafes ile 35 mm kültür çanağı için transfer edilir. Aynı anda c ekleme sırasında, yavaşça ACSF çıkarmak için bir 3 ml&#39;lik plastik transfer pipeti kullanarak, çözelti yerineKALSİYUM boya çözeltisi çalışıyor. </li><li> % 5 CO 2 gazı kontrollü bir ortamda 30-60 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücreleri girmedi boya uzak yıkamak için ACSF dolu tutarak odasına geri dilim yerleştirin. Alternatif olarak, bir ACSF çalıştıran mikroskop perfüzyon odasının doğrudan yerleştirebilirsiniz. Bu yıkama dönemi 30-45 dk. </li><li> Perfüzyon odasına dilim aktarın. </li></ol></li><li> Boya basınç uygulaması <ol class="lalpha"><li> Tutarak odasından mikroskop kurulum perfüzyon odasına dilim aktarın. </li><li> Mikromanipülatör 250 uM ve yerinde bir çalışma solüsyonu bir cam pipet doldurun. </li><li> Ilgi bölgeye pipet indirin. Pipet ucu uzağa kaydedilen bölgeden ya da kesit yüzeyinin altında birkaç mikrometre kesit yüzeyi üzerinde ya da birkaç mikrometre gömülü olduğunu, ancak bu gibi yerleştirilebilir. Pipet açısı affe vermedict yükleme verimliliği. Dilim yüzeyden görüntüleme, biz görüntüleme düzleminin altında pipet yerleştirmek iyi bizim istenen görüntüleme alanı etiketleyecektir bulduğunda. </li><li> O &lt;3 psi olacak şekilde baskı boya uygularken, Picospritzer ayarlayın. Bu pipet ucu çapı değişkenliğe tabidir, çünkü boya difüzyon hacmi tahmin değil, basınç uygulanır ve boya enjekte edilir doku yoğunluğu. Göz ile değerlendirilen bizim istenilen yükleniyor elde edene Biz sadece geçerlidir. Ucu dilim yüzeyinin altına yerleştirilir, özellikle uygulama sırasında dilim hasar en aza indirin. 1-2 dakika boyunca uygulayın. Bazen tekrarlanan uygulamalar göz tarafından değerlendirilen etiketleme bağlı gereklidir. Bu konsantrasyon ve uygulama süresi için, yüzey uygulaması aşağıda tercihen astrositler etiketler iken boya bu yüzey uygulaması tercihen nöroblast etiketler bulabilirsiniz. Ancak, 500 mcM az&gt; 3 dk uygulama da nöroblast etiketleyecektirbakılmaksızın ucu yukarıda veya aşağıda dilim yüzey (JC Platel, yayınlanmamış gözlem) olup olmadığı. 30-45 dk yıkama ve dilim kurtarma için izin ver. </li></ol></li></ol> 6. Kalsiyum Faaliyet Konfokal Görüntüleme <ol><li> Böyle 4x veya 10x gibi düşük bir güç amacı ile ilk faiz bölgesini bulun. Yüksek bir güç objektif geçmeden önce alanın ortasına yerleştirin. Bu noktada, bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) altında SVZ hücrelerin görünümünü belirterek genel dilim sağlığını ölçebiliriz. Sağlıklı hücreleri yuvarlak ve dolgun görünür. Tüm veya parlak floresan (ölmekte olan bir hücre) hiçbir yükleme gerekiyordu Buna ek olarak, sağlıklı hücreler soluk Fluo-4 yükleme gösterecektir. </li><li> Ilgilenilen bölgenin üzerine su-immersiyon objektif indirin, şimdi hangi boya yüklü olduğunu. 40x Daha geniş bir görüş alanı sağlar ve daha pipet erişim sağlar rağmen 40x veya 60x objektif Ya, bizim ihtiyaçlarımız için yeterli olmuştur. Ne zaman aşağıda görüntülemeyüzeyi, sık sık 3-boyutlu mimari ve hücre sağlığı daha iyi korunur dilim yüzeyin altında en az 15 mikron gidin. </li><li> Perfüzyon ve vakum yeterli çalıştığından emin olun. </li><li> O zaman atlamalı çözünürlük ve uzaysal çözünürlüğü istenen oranları ayarlanır böylece mikroskop ayarlayın. Konfokal mikroskopi için, bu faktörler genellikle sistemin tarama doğası nedeniyle uzaysal çözünürlük kaybına neden zamansal çözünürlükte bir artış olarak dengeli olmalıdır. Kalsiyum etkinliği için, bir 512x512 piksel çözünürlüğe sahip yaklaşık her saniyede bir kare görüntülenmiş var. Ayrı olarak elde birden fazla kanal gerekli ise, bu aynı zamanda satın alma oranlarını etkileyecektir. Filmin süresi (2-10 dakika) ayarlayın. </li><li> Çalıştırın başlatın. Farmakolojik çalışmaların icra ise, en azından 5-10 dakika için antagonistler veya agonistler olmayan desensitizasyon üzerinde yıkama, ve daha sonra 5-10 dakika arasında bir film yapmak. Reseptör agonistleri olabilir duyarsızlaştırmak akut bir PR kullanılarak gibi uygulanabilir,Bir mikromanipülatör tarafından kontrol pipet essure. </li></ol> 7. Kalsiyum Analiz Analiz biz geçirgen yayınlarda 2-4 açıklanan standart prosedürleri izler. F 0 (yani temel) ve F faiz (ROI) bölgelerinin tüm boyunca ve her bir ROI ölçülen ortalama floresan yoğunlukları, sırasıyla. Floresans bir değişiklik bu F / F 0 artış&gt;% 15 ise bir Ca 2 + artış olarak kabul edildi. Hücre içi Ca 2 + değişimleri Calsignal 5 kullanılarak hesaplanmıştır. 8. Temsilcisi Sonuçlar Biz yukarıda ve başka 2-4,6 açıklanan boya yükleme protokollerinde bağlı SVZ hücrelerin seçici yükleme elde etmek mümkün olmuştur. Çoğunlukla Fluo-4 AM (sırasıyla 4-5 veya 250 uM), etiket nöroblast dilim yüzeyinde Hamamı yükleme veya basınç uygulaması. Basınç uygulaması neurob yükleyebilirsiniz ikendaha hızlı tek bir dilim banyo yükleme uzun sürerse, banyo yükleme birden çok dilim aynı anda yüklenmesine olanak sağlar. Biz onlar göç davranışlarını 4,7, (2) bunların morfolojisi, sulforhodamine 101 (3) negatif boyanma, bir astrosit özel boya 3 veya (4) pozitif boyanma ile göstermek ister (1) tarafından nöroblast olarak etiketlenmiş hücrelerin kimliklerini doğrular DCX-DsRed ifade (JC Platel, yayınlanmamış gözlem). Nöroblast fizyolojik sıcaklıkta 4,7-9 da (60 um / saat arasında ortalama) hızlı bir geçiş, fakat kolayca hareket oda sıcaklığında dahi görülmektedir. Nöroblast hareketi bizim filmler tipik süresinin kısa olması nedeniyle bölge-faiz (ROI) kalsiyum etkinliği izlemek için yerleştirme açısından bir sorun teşkil etmez. Ancak, ilaç çözüm değişimleri sırasında gibi uzun bekleme süreleri sırasında, araştırmacılar kontrol ve tedavi dönemlerinde ROI&#39;ler eşleştirmek için dikkatli olmak gerekir. Nöroblast içine veya i dışına göç için nadir değildir<html> maging alan veya odak düzlemi. Dilim içine ve sınırlı bir süre (&lt;2 dak) için derin Fluo-4 AM (250 uM) basınç uygulaması tercihen SVZ astrositler 2 etiketler. Astrosit etiketleme özellikle biz son 3 anlattığımız kan damarları ile ilgili projeksiyonlar ve endfeet varlığı ile, sulforhodamine 101 ve morfolojisi ile pozitif etiketleme tarafından doğrulandı. Bu yöntemleri kullanarak, biz SVZ neuroblast ve astrosit nüfus (Şekil 1) hem de spontan aktivite gözlemledik. Astrositlerde faaliyeti genellikle damar 3 meşgul dalgalar halini alır. Ayrıca, bir test olarak kalsiyum görüntüleme kullanılarak, farmakolojik agonistleri uygulama ortaya ya da GABA ifade nöroblast 4 nöroblast ve astrositler 6 A reseptörleri ve AMPA reseptörleri NMDA teyit etmiştir. Figürler 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Astrositler kalsiyum aktivite Çoğaltım. (A) Temsilcisi kalsiyum aktivitesinin bir time-lapse kayıt gelen görüntüyü ortalama. SVZ içinde astrositler Fluo-4 basınç uygulaması ile yüklenen dilim derinliklerine AM. Filmler 0.75 s zaman aşamada elde edildi. Ilgi alanları (ROI) aktivitesi gösteren hücreleri üzerine yerleştirilir. (B) ROI&#39;ler gelen izleri (A) tasvir film hücreleri üzerine yerleştirilir. İzler bir hareketli ortalama ve normalize ile filtre edildi. Dikey ölçek 2 temsil x hızındaki / F sinyal yoğunluğunu ve F 0 ortalama bazal sinyal ve hızındaki = FF 0 F 0. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Şekil 2. Perfüzyon sistemi Resim. Bir tüpün bir ucunun% 95 O2 /% 5 CO2 gaz-p battığındaerfused çözüm. Çözelti, daha sonra, bir peristaltik pompa (gösterilmemektedir) ile bir tüp ve banyo oda için perfüze edilmiştir. Diğer ucunda bir platform üzerine monte edilmiş küvet odasının giriş çözelti içine yerleştirilir. Aspirasyon ucu sonra odasının çözümü prizine bağlı ve çözüm yüksekliğini belirlemek için bir düzeyde ayarlanır. Çıkış itibaren, emme ucu odasından gelen bir atık kap içine çözelti vakum aspirasyon hattına bağlanır. Perfüzyon sistemi Görsel netlik için mikroskop sahneden gösterilir.

<ol>
	<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells.">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li><li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis.">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li><li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels.">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).</li><li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone.">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li><li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+controls+Ca2++activity-dependent+network+synchrony+in+the+adult+neurogenic+forebrain.">GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain.</a> , (2007).</li><li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes.">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li><li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ.">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

SVZ hücrelerinin kalsiyum görüntüleme nöroblast 10, hem nöroblast ve astrositler 4,6,8 ve astrositik kalsiyum dalgalar 3 reseptör kanal ifadede spontan aktivitede desen çalışması için kullanılır olmuştur. SVZ hücreleri ya olgunlaşmamış veya glial özelliklere sahip olduklarından olgun ağlarındaki aktivite göstergesi gerilim potansiyeli milisaniyelik değişimler bu bölgede geçerli değildir, yani aksiyon potansiyelleri 11,12 kovmayın. Bu nedenle, yava...

<table border="1"><tbody><tr><td> Çözünen </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Diseksiyon (mM) </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Diseksiyon: 147 mM ACSF: 0 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Diseksiyon: 42 mM ACSF: 126 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Diseksiyon: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 .6 H2O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Diseksiyon: 4.33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> 2 PO 4 NaH. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Diseksiyon: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM, </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> Disseşeklinde gösterilmektedir: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Diseksiyon: 26 mM ACSF: 26 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H2O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Diseksiyon: 1.33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kimyasal listesi ve diseksiyon çözüm ve ACSF tarifleri. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Başlık] </td></tr><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold veya 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue veya 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Diseksiyon araçları </td><td> Roboz yada Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 kalsiyum duyarlı boya AM </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1 kalsiyum duyarlı boya AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO içinde Pluronic F-127% 20 çözelti </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Dik konfokal mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> FV300 veya FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Su daldırma hedefleri </td><td> Olimpos </td><td> LUMPlanFl 40 x G / IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x G / I (NA 0.90) </td><td></td></tr><tr><td> Mikromanipülatörler </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Basınç kontrol &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> Uygulama sırasında &lt;3 PSI </td></tr><tr><td> Pipet çektirme </td><td> Sutter veya Narshige </td><td> Sutter P-97 veya Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Cam pipetler </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1.10, OD: 1.50 </td></tr><tr><td> Peristaltik pompa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Model 720 </td><td> akış hızı: 1 ml / dak </td></tr><tr><td> Odası banyosu </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26, GLP </td><td> Düşük profilli objektif açıklığı sağlar </td></tr><tr><td> Borular </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrol </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Malzeme / ekipman listesi.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

Subventricular bölgesi (SVZ) doğum sonrası beyinde iki nörojenik bölgelerinin biri. SVZ astrositik özellikleri (SVZ astrositler denir), nöroblast, orta ve progenitör hücreler ile nöral progenitör hücreler gibi yoğun dolu hücreleri içerir. SVZ doğumlu nöroblast teğet onlar internöron içine ayırt koku ampul, büyük bir mesafe göç. Adezyon molekülleri ve difüze sinyalleri aracılığıyla intraselüler sinyalizasyon kontrol nöron önemli roller oynamaktadır. Bu sinyallerin çoğu hücreleri içinde ve arasında bilgi aktaran hücreiçi kalsiyum etkinliği tetikleyebilir. Kalsiyum faaliyet dışı sinyallerin faaliyet böylece yansıtıcı ve SVZ hücreler arasındaki fonksiyonel hücrelerarası sinyallerini anlamak için optimal bir yoldur. Kalsiyum aktivite olgun astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere diğer birçok bölge ve hücre tipleri, çalışılmıştır. Ancak, loa için geleneksel yöntemkalsiyum gösterge boyası (yani banyo yükleme) ile d hücreleri tüm SVZ hücre tipleri yükleme at verimli değildi. Gerçekten de, SVZ de hücresel yoğunluk doku içinde yayılma boya engellemektedir. Buna ek olarak, daha iyi sagital dilimleri hazırlamak özellikle SVZ hücreleri, rostral-kaudal eksen üzerinde neuroblast göç akış üç-boyutlu düzenlemeleri koruyacaktır. Burada, SVZ, kalsiyum göstergesi boya ile SVZ hücrelerin yükleme ve zaman atlamalı filmleri ile kalsiyum faaliyet edinimi içeren sagital kesitler hazırlamak için yöntemler tarif. Biz kullanılan Fluo-4 doku içindeki basınç uygulamasını kullanarak SVZ astrositler yüklenmesi için boya AM. Kalsiyum etkinlik ayırt tek tek hücreler için kesin bir çözüm sağlayan bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak kaydedildi. Bizim yaklaşım erişkin hipokampal subgranular dilimi ve embriyonik nörojenik bölgeleri dahil olmak üzere diğer nörojenik bölgeleri için geçerlidir. Buna ek olarak, boyalar, diğer tip olabilirTarif edilen yöntem kullanılarak yapılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging at JoVE.com

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Video: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Nörobilim

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...