Nöronal morfogenezi incelemek için dendritik veya aksonal arborsların tek hücreli etiketlenmesi ve görselleştirilmesi gereklidir. Gelişmekte olan arborları minimal invaziv bir şekilde etiketleyerek, retina dokusu sağlıklı kalır ve uzun süreli konfokal canlı görüntüleme için uygun kalır. Bu yöntemin temel avantajı, enjeksiyondan sonraki dört gün içinde çok renkli floresan proteinlerle bireysel arborları görselleştirme yeteneğidir.
Bu, yenidoğan ağaç dikme morfolojilerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu enjeksiyon görüntüleme ve analiz protokolü, merkezi sinir sistemindeki nöronal morfolojileri incelemek için kullanılabilir. İlgilenilen hücre popülasyonunu hedeflemek için uygun Cre seçimi ve enjeksiyon yeri belirlenmelidir.
İlgilenilen retinal hücre popülasyonlarını etiketlemek için bir Cre fare çizgisi seçerek başlayın. Floresan proteinleri kodlayan rekombinaza bağımlı AAV virüsü elde edin. İnce proseslerin optimum şekilde etiketlenmesi için, plazma zarını hedef alan modifiye floresan proteinlerini ifade eden vektörleri seçin.
Buz üzerindeki AAV aliquot için steril salin veya PBS kullanarak bir ila dört AAV seyreltme hazırlayın. Enjeksiyonları görselleştirmek için, her 15 mikrolitre AAV seyreltmesi için yaklaşık bir mikrolitre% 0.02Hızlı Yeşil FCF boya çözeltisi ekleyerek çözeltiyi maviye renklendirin. Enjeksiyon alanını% 70 etanol ile sterilize edin.
Mikropipeti bir mikroşırınga kullanarak AAV seyreltme ile doldurun. Stereo mikroskop altında, ucun mührünü açmak için mikropipet ucunu 30 gauge'lik bir iğneyle kırın. Yenidoğan farelerini uyuşturduktan sonra, hayvanları tanımlamak için 30 gauge'lik bir iğne kullanarak pençe pedlerini dövme mürekkebi ile dövmeyin.
DNA izolasyonu ve genotipleme için kuyruk kırpıntılarını toplayın. Gözlerin üzerindeki cildi% 70 etanol ile silin. Gözü açmak için parmaklarınızla hafif basınç uygularken kaynaşmış göz kapağını açmak için 30 gauge'luk bir iğne kullanın.
Kornea sklera kavşağındaki korneadan küçük bir delik açın. Cam mikropipeti deliğe yerleştirin ve AAV'yi intravitreal boşluğa enjekte etmek için mikro enjektör ayak pedalına iki ila dört kez basın. Mikropipeti yavaşça çıkarın ve göz bebeğindeki mavi boyayı görselleştirerek AAV enjeksiyonunu onaylayın.
Metin makalesinde açıklandığı gibi retinal aCSF'yi hazırladıktan sonra, retinal aCSF'yi en az 15 dakika boyunca karbojenle köpürterek oksijenlendirin, ardından pH'ı 7.4'e ayarlayın. 60 milimetre çapında bir Petri kabını bir buz tepsisine yerleştirin ve oksijenli retinal aCSF ile doldurun. Doldurulmuş Petri kabını stereo mikroskop altına yerleştirin.
Ardından, gözü açığa çıkarmak için ötenazi faresinin göz kapağı kapağını kesin. Gözleri enüklee etmek ve stereo mikroskop altına yerleştirilmiş soğuk retinal aCSF'ye aktarmak için künt forseps kullanın. Stereo mikroskop altında, beş numaralı forseps Dumont'u kullanarak optik siniri sıkıştırarak gözü stabilize edin ve korneanın merkezinde 30 gauge'luk bir iğne ile bir delik açın, ardından delikten korneanın sonuna kadar bir kesi yapmak için mikro makasın bir ucunu deliğe yerleştirin.
Kardinal yönlerde dört dilim yapmak için tekrarlayın ve dört kanat oluşturun. İki bitişik flebi kavrayın ve birbirinden ayırın, sklerayı retinadan tüm kornea flepleri için yavaşça soyun. Ardından forsepsleri kullanarak lensi retina kabından çıkarın.
Son olarak, retinanın kenarından optik sinire doğru dört radyal kesi yapmak için mikro makas kullanın ve dört eşit taç yaprağı oluşturun. Montaj için büyük çaplı gri MCE membran filtreler kullanıyorsanız, diski kabaca bir santimetre genişliğinde kadranlar halinde kesin, ardından MCE diskini daha büyük bir beyaz filtre kağıdının ortasına yerleştirin. İki boyut üçe sıfır boya fırçası kullanarak, retinal gangliyon hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde bir retinal fincanı boya fırçasına çevirin.
Retinayı nazikçe aCSF'den kaldırın ve su gerginliğinin retinayı yırtmadığından emin olun. Boya fırçasını retina ile tutmaya devam ederken, aCSF içeren Petri kabını yoldan çekin ve beyaz filtre kağıdını MCE membranı ile stereoskobun altına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, MCE filtre kağıdının ortasına bir aCSF damlacığı yerleştirin.
Retinayı, yüzey gerilimi ve yüklü MCE membranı tarafından oluşturulan aCSF damlacığına yüzdürün. Retinayı damlacık içinde retinal gangliyon hücresi tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırmak için boya fırçaları kullanın, ardından dört yaprağı açın. Yerleştirildikten sonra, damlacığın yüzey gerilimini kırmak için boya fırçası ile beyaz filtre kağıdı arasında bir su köprüsü oluşturun.
Canlı görüntüleme inkübasyon odasını monte edin ve oksijenli aCSF ile doldurun. Sıcaklığın 34 santigrat derecenin üzerine çıkmadığından emin olarak pompayı ve sıcaklık kontrol cihazını açın. Oda sıcaklığının dengelenmesi bir saat kadar sürebilir.
Retina diseksiyonuna başlamadan önce kuluçka odasının kurulması önerilir. Kararlı oda sıcaklığı, numune sapmasını azaltmaya yardımcı olur. Retinal düz höyüğü perfüzyon odasına aktarmak için, pompayı durdurun ve odadaki aCSF'yi çıkarın.
Daha sonra MCE diskini retinal düz montajla inkübasyon odasına yerleştirin. Yüzey gerilimini kırmak için bir numune ağırlığını önceden ıslatın, ardından düz montajın üzerine yerleştirin ve numune sapmasını azaltmak için numune ağırlığının MCE kağıdına yerleştirilmesini sağlayın. Odayı ısıtılmış aCSF ile doldurun ve aCSF'yi dakikada yaklaşık bir mililitrede dolaştırın.
Burun parçasını, görüntüleme odasına 25 kez su batırma hedefiyle konumlandırın. Epifloresan ışığı kullanarak etiketli hücreleri görüntüleyin ve ilgilenilen dendritik özellikleri yakalamak için görüntüleme hacmini ayarlayın. Hem aşırı doymuş hem de az doymuş pikselleri tanımlayan bir arama tablosu kullanarak, lazer gücünü hiçbir pikselin aşırı doymamış olacağı şekilde ayarlayın.
3D görüntüleme hacmini elde edin ve elde etmeyi istenen kare hızında tekrarlayın. Görüntüleme hacmi, numune sapmasını telafi etmek için her zaman noktası arasında ayarlanabilir. Görüntü serilerini içe aktarın ve görüntüleri zamana göre bölün.
Tüm zaman noktalarını manuel olarak veya bir makro eklentisi çalıştırarak kaydedin. Doğru bir PSF oluşturmak için ImageJ eklentisini kullanarak ImageJ eklentisini kullanarak teorik bir nokta yayılma işlevi oluşturun, doğru bir PSF oluşturmak için lens sayısal diyaframı, florofor emisyon dalga boyu, piksel boyutu ve Z aralığı gereklidir.
Dosyayı, içe aktarmayı ve ardından görüntü dizisini tıklayarak tüm belirsizleştirilmiş zaman noktalarını yığın olarak içe aktarın. Görüntüyü, hiper yığınları, ardından yığınları hiper yığına tıklayarak yığını hiper yığına dönüştürün. Z-dilimlerinin ve zaman dilimlerinin sayısını ekleyin, ardından doğru 3D drift eklentisini kullanarak 3D drift'i düzeltin.
3B sapma düzeltilmiş hiper yığını kaydedin ve görüntüyü, hiper yığınları, yığın için hiper yığını tıklatarak görüntüyü normal bir yığına dönüştürün, ardından görüntü, yığınlar, araçlar ve yığın ayırıcıyı tıklatarak zaman noktalarını bölün. Bölünecek alt yığın sayısı için zaman noktası sayısını girin. Tüm zaman noktaları için maksimum projeksiyon oluşturmak üzere toplu işlemeyi kullanın.
Dosyayı, içe aktarmayı ve ardından görüntü sırasını tıklayarak hızlandırılmış görüntü dizisini içe aktarın. Ve deconvolved ve post işlenmiş iki boyutlu videonun istenen analizi için geleneksel ImageJ araçlarını kullanın, Yıldız patlaması hücre dendritleri geliştiren yüksek çözünürlüklü bir 3D video elde edildi, deconvolved ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Z-düzlemi maksimum projeksiyonları, analiz için 2D videolar yapmak için üretildi, bir dendritik arıtma alanı ve bir dendritik büyüme alanı gösterdi.
Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ImageJ ile dekonvolüsyondan önce ve sonra tek P6 yıldız patlaması amakrin hücresinin ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırdı. Uzun süreli AAV enfeksiyon dönemleri, enjeksiyondan sonraki beş ve 11 gün içinde benzer seviyelerde protein ekspresyonu ile gösterildiği gibi floresan sinyalinin artmasına neden olmaz. Görüntüleme sırasında numune kaymasının azaltılması önemlidir.
Tutarlı bir görüntüleme sıcaklığı korunarak ve numune üzerindeki ağırlığın uygun şekilde konumlandırılmasıyla sapma en aza indirilir. Sapma meydana gelirse, zaman serisinin manuel olarak alınması, çerçeveler arasındaki görüntüleme hacminin ayarlanmasına izin verir. Bu, ilgilenilen özelliklerin çerçevede kalmasını sağlar.
Bu protokol, gelişmekte olan nöritlerin yüksek çözünürlüklü, deconvolved ve drift düzeltmeli 3D videolarını üretir. Bu tür videolar, nöron kablolamasının daha iyi anlaşılmasına yol açar ve 3D morfogenezin hesaplamalı analiz yöntemlerini ilerletmek için gereklidir. Nörit gelişiminin yüksek verim analizini elde etmek için daha iyi otomatik izleme ve izleme yazılımları gereklidir.
