Yararlı yorumlar ve yapıcı tavsiye için üç anonim yorumcular teknik yardım için Willy Güneş ve Dr. Kris Gellynck için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sunnybrook İşitme Yenilenme Girişimi tarafından finanse edildi

Fare doku korunur ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Hayvan Bakımı kurallar üzerinde Kanadalı Konseyi çerçevesinde ötenazi farelerde 12 -reporter Sox2 EGFP hasat edildi. 1. Kültürleme Embriyonik Cochleae <ol><li> 8.89 mL DMEM, fetal sığır serumu ve 1 ml (FBS), 100 x N2 ek 100 ul ve / ml siprofloksasin, 10 mg, 10 ul karıştırılarak Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) Supplement. % 100 HEPES, 5 ml ile 495 ml HBSS karıştırılmasıyla Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), Supplement. </li><li> Cam alt kültür yemekleri hazırlayın: <ol><li> Bir laminar akış başlığı içinde, 5 ml DMEM içinde 200 ul bazal membran ekstraktıdır alt-tabakanın yeniden süspanse edin. 10 mm kuyu ile 35 mm çapındaki cam alt kültür yemekleri hazırlayın. Her cam merkezi için pipet 150 ul alt tabaka / DMEM dipli çanak. Bu yemekler 40 dakika inkübe edildikten sonra kullanılabilir, veya bir CO 2 depolanabilir </sub&gt; En az bir hafta boyunca 35 ° C&#39;de kuluçka makinesine kondu. NOT: çanak taban şeffaf ve görüntüleme için uygun olduğundan emin olmak için, iyi eksplantlar nihayet kolayca bulunduğu alanda yerleşmek için izin verir ve yemeğin ortasında bir oluşturmak için: Cam yemekler aşağıdaki nedenlerle kullanılır dipli bu nedenle, bir deneyden sonra numune immüno-boyama ve bir sonraki analiz için işlenebilmesidir. </li></ol></li><li> Iş istasyonu ve araçları hazırlayın: <ol><li> Laminer akımlı temiz tezgah açın ve temiz bir çalışma alanı oluşturmak için% 70 EtOH ile aşağı püskürtün. % 70 EtOH (madde (1 kısım) ve kömür tozu (2.5 g), sertleştirme 184 silikon elastomer (10 kısım) bir karışımı) forseps, kaşık ve siyah 184 silikon elastomer çanak bekletin. </li></ol></li><li> Temiz çalışma istasyonu, deney için hasat embriyolar. Soğuk HBSS% 1 HEPES buz uygun gebeliğin embriyolar toplayın. <ol><li> Göstereceğiz harici veya görünür organını belirleyinmuhabir aktivitesi ve bir floresan stereo mikroskop kullanılarak embriyolar inceleyin. Deneyin konusu bu olarak% 1 HEPES ile takviye edilmiş olan, soğuk HBSS buz reporter aktivitesini sergileyen embriyolar toplayın. </li></ol></li><li> Zamansal kemikleri toplayın: <ol><li> Serin bir ışık kaynağı ve ince forseps kullanarak, hızlı bir çalışma, yavruların kafalarını toplamak. Temporal kemiklerin zarar görmesini önlemek için servikal omurlar seviyesinde ve çene altında klibi için özen gösterin. </li><li> Dikkatle kafatası açın. , Beyin çıkarın başının ön keserek ve temiz bir tabak% 1 HEPES taze buz HBSS&#39;nin için arka kafatası aktarın. Dikkatle inceliğini vestibüler sistemin tutmaya özen fıstık şeklindeki zamansal kemikleri teşrih. </li></ol></li><li> Kokleayı ayır: <ol><li> Soğuk HBSS,% 1 HEPES, buz içerisinde siyah bir silikon elastomer kaplı tabak ve temporal kemik transfer kemik vestibüler bölgesini pin. Böcek işaretçilerine takıntemporal kemik stabilize ve forseps için bir oda oluşturmak için bir eğik açı. Temporal kemik bir sağlam koklea hasat etmek çok zordur çok fazla hareket etmesine imkân tanınır gibi Sabitleme sürecinde çok önemli bir adımdır. </li><li> Dikkatle kokleayı çevreleyen kıkırdak çıkarın. Koklea tabanının dış kenarında kıkırdağa forseps bir dişe yerleştirin ve kıkırdak içine bir delik klip. </li><li> , Yan bir kapağını Clip forseps tine yerleştirin ve yavaşça kıkırdaktan kanalının çatı ayırın. Çapraz ve üst kısmında yatay Klip ve dikkatle kapsülün ön kısmını kaldırın. Kalan kıkırdak ve kanal arasında forseps bir ucu yerleştirin ve yavaşça son bölümü off klibi. Kokleanın apikal yüzeyi artık maruz kalmaktadır. </li><li> Üssünde başlayan, kanalın çatı koklear epitel karşılayan alanını yakalamak ve koklear kanalı açın. Yavaşça kırparak, çatıdan soymagerektiğinde tamamen kaldırılana kadar. Kanalın medial tarafında sol zarın herhangi bölümlerini keserek. Aşırı mezenkimal doku kanalı temizleyin ve vestibüler sistemden kanalı ayırmak. </li></ol></li><li> Kültür, eksplantlar: <ol><li> Dikkatle, bir alt tabaka kaplanmış cam alt kültür çanak merkezinde, bir eksplantın, lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin sıvının tüm kapalı çizmek ve iki dakika bekletin. Onu rahatsız etmemek için özen DMEM damla-bilge eksplantasyona takviye 150 ul ekleyin. Eksplant, serbest yüzer forseps ile yeniden konumlandırmak, ancak yüzeye tutunur, böylece eksplant yemeğin altına yerleşir dikkat etmelisiniz. </li><li> Nem elde etmek için steril su içinde küçük bir tabak, derin bir 12 cm çaplı bir petri tabağına cam alt yemekler yerleştirin. Gece boyunca eksplant substrata yapışır ve düzleştirmek için sırayla 35 ° C inkübatör içinde kültürleri koyun. </li></ol></li></ol> 2. Canlı Imaging <ol><li> Eksplant örnekleri seçin. Her Eksplante cochlea&#39;nın durumunu değerlendirmek için bir floresan stereo mikroskop kullanın. Kanal bozulmamış ve doruk tabanından camına yapışarak burada sadece eksplantlarını seçin. </li><li> Kültür koklear dokuya% 5 CO2 ile 35 ° C&#39;de kuluçka ayarlayın. Inkübatör mikroskop içine kültürleri koyun: <ol><li> Yavaşça takviye DMEM aspire ve en az 500 ul taze medya ile değiştirin. 6 gün kadar görüntüleme için 1-1.5 ml iyidir. Eksplantlar gevşek bir şekilde bağlı olması halinde, çanak kenarı etrafında ortamın bir halka pipetle. Bu matrise eklemek için devam ederken bu ekstra sıvı eksplant bozmadan bir minyatür &#39;nemlendirilmelidir odasını&#39; yapacak. <ol><li> Alternatif olarak, kullanım reaktifler görüntü koleksiyonları arasında aralıklarla sırasında değiş tokuş gerekiyorsa çanak mikroskop kendi uydurma kalır iken çanak kapaklarını açmak için kapakları menteşeli. Menteşeli çanak kapakları kapakları olmasına izinörnekleri rahatsız ya da ayarlarından yemekleri çıkarmadan açıldı. Bu sonraki görüntü yakalar için onların tam konumunu sürdürmektedir. </li></ol></li><li> Numune çanak tutucu içine uygun örneklerini içeren cam alt yemekleri yerleştirin. Bu örnekte mikroskop sekiz 35 mm numune yemekler sahip dönüşlü bir platform bulunmaktadır. </li><li> Laminer akış kaputun altında cam kapaklı plastik kapaklarını değiştirmek ve numune çanak tutucu içine yemekleri yerleştirin. Yemeğin altından eksplantlarm çıkarmak için ya da medyayı rahatsız değil inkübatör alarak bakımı içinde örnek çanak tutucu yerleştirin. </li></ol></li><li> Görüntüleme rutin ayarlayın: <ol><li> Mikroskop, UV lamba ve fotoğraf makinesini açın ve görüntüleme yazılımını açın. </li><li> , Örnekleri bulun sırayla her yemek için pozlama süreleri, bir görüntüleme alanı seçin odak düzlemi ve ayarlayın. Odak başlama zamanında eksplant görünüme sadece bağlı düzlemini seç, ancak Elböylece doku nasıl hareket edeceği ve zaman ders çalışacağını ne kadar göz önünde. </li><li> Floresan kanal seçilen odak düzlemi etrafında yoğunlaşan Z yığını ayarlayın. Deney için numune alma sıklığını ve uzunluğunu ayarlayın. Örnekleme sıklığı, görüntüleri toplamak için gereken zaman ile sınırlı olacak, bu yüzden bu görüş alanları seçme ve Z yığın ayarlandıktan sonra tespit edilmelidir. Bu durumda örnekleme beş gün boyunca her 30 dakikada bir gerçekleşir. Deney süresi 14 güne kadar olabilir. </li></ol></li><li> Bir film oluşturmak: <ol><li> Zaman atlamalı döneminin sonunda görüntü dosyalarını açmak. Ardışık toplama noktaları açar, bu durumda Metamorph yazılımı kullanılmaktadır. Kare kare ilgi hücre popülasyonu gösteren en iyi odak düzlemi seçin. </li><li> Bir avi dosyası bu görüntüleri dönüştürmek, ya da birden fazla forma açıldı ve analiz görüntü işleme yazılımı veya dönüştürülebilir görüntülerin bir dizi oluşturmak için bir montaj olarak bunları ihraçvideo işleme yazılımı kullanarak ts. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürler kurulur ve uzun vadeli görüntüleme için sırayla time-lapse mikroskop kurma zaman dikkate alınması gereken birkaç teknik nokta vardır. Bu koklear eksplantların kültürlenmesiyle için bir alt tabaka olarak temel membran matrisi, ancak alt-tabaka, hücre tipi için uygun olmalıdır. Örneğin, görüntü nöron kültürleri ile, bir fibronektin kaplamasının temin edilmesi için daha iyi olabilir. Kuluçka sıcaklık ve gaz bileşimi, aynı zamanda, doku tipine bağlı...

Memeli salyangozunun bir çok sipariş karmaşık bir organdır. Fare, doğum sonrası erken aşamalarında otik gün E11 üzerinde vezikül ve gelişimsel programın tamamlanmasından itibaren ilkel iç kulağın ortaya çıkması arasında, hücre sinyal birden dalgaları ve gen ifadesi koordine değişiklikler gerçekleşir. Koklear kanalın doruk tabanından çalışan Corti duyusal epiteli, organ ya da tespit sesidir. Corti organı Kalkınma zarif gelişme sonunda, bu iç saç hücrelerinin tek bir satır oluşacaktır şekilde kontrol edilir, dış saç hücrelerinin üç sıra destek hücrelerin beş satır (sütun hücrelerin iki satır, üç serpiştirilmiş Deiters &#39;hücrelerin satır) 1. , Işitme kaybı oluşumu ve duyusal epithemlium 2 desenlendirme kesitler studye önemini heighlighting Bu kesin emir sonuçlarından sapma. Embriyonik fare Coch in vitro kültür içindelea Corti organı gelişme mekanizmaları eğitim önemli bir araçtır. Bu teknik 1974 yılında kurulmuş ve son 40 yıldır, duyusal epitel belirtilen ve Corti organı 3 kurulduğu tarafından mekanizmaların birçok aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Cochlea dinamik gelişim süreçleri ile karmaşık bir organdır; yedi gün 1 tezahür olarak bir manipülasyon olarak uzun sürebilir. E13 bir koklear eksplant kültürü için GSK, 3β inhibitörlerin eklenmesi, örneğin,, en uygun kuluçka süresi bileşiğinin güçlü bir etkisi altı gün 4 gözlemlemek. Gelişmekte Kokleanın Canlı görüntüleme Corti organı morfoloji değişiklikleri soruşturma verir, gen ifadesi değişiklikleri, göç ve izleme çoğalan veya hücreleri ölüyor, ve gerçek-zamanlı ilaç ajanların sonuçlarının gözlem ve sinyalizasyon bozulması sağlar yollar. Şimdiye kadar, Kokleanın Canlı görüntülemeyeağırlıklı olarak kısa süreler 5-8 üzerinde Corti organı görüntü küçük alanlarda konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen, ancak bu tekniğin eksplant canlılığı nedeniyle sınırlamalar sahiptir. Yavaş gelişim süreçleri uzun süreli manipülasyon etkilerinin görüntülemede, görüntüleme ortamında çok önemlidir. Tipik bir konfokal canlı görüntüleme sistemi mikroskop oturur nemlendirilmiş bir plastik kutu kullanır. Isı ve nem gibi objektif veya ışık kaynağı olarak eklemli açıklıklar içinden ve microscope- çeşitli parçaları etrafında boşluklar aracılığıyla, erişim pencerelerden, mikroskop tablo uygun kuluçka kutusuna boşluklar kaçabilir. Bu fazla iki veya üç gün boyunca sağlıklı eksplantlarını korumak için optimal değildir. Biz standart bir CO 2 inkübatör içinde mühürlü bir ters mikroskop yerine mikroskop etrafında inşa edilen bir inkübatör olarak &#39;inkübatör mikroskop&#39; tanımlar. Bir inkübatör mikroskop exDeneyin ömrünü uzatmaktadır yerine, iki veya üç gün boyunca görüntüleme daha, örnekler iki haftaya kadar süre için görüntülü şekildedir. Bir inkübatör mikroskop kültürleri ve standart kontrollü koşullar eksplantasyona minimal rahatsızlık, hücre büyümesi ve farklılaşması için mükemmel bir ortam sağlar. Birden fazla gün içinde yer alan çalışmalarda inkübatörden çıkardıktan ve bir ters flüoresan mikroskop bunları taşıyarak günlük olarak görüntüleme örneklere başvurmak olağandır. Bu yaklaşım işe iken, inkübatör bulaşıkları kaldırma duyarlı gelişmekte olan doku üzerinde stres uğratan. Nedeniyle inkübatörden çıkarıldıktan için sıcaklık kültürleme orta ve dalgalanmalar asit değişiklikleri optimal gelişim ve sağlıksız dokuya neden olabilir. Aynı odak düzlemi ve her zaman noktasında aynı yönde aynı bölgeyi görüntüleme son derece zordur. Bir inkübatör içinde otomatik bir sistem kullanılarak, sağlıklı sağlamak mümkündürdoku, daha fazla zaman noktalarında görüntüleri toplamak ve aynı alan her karede yakalanmasını sağlamak için. Son yıllarda birçok entegre mikroskop doku inkübatör, geliştirilen bu klinik pratikte 9 değil aynı zamanda kök hücre ve kanser araştırmalarında 10,11 değil sadece yararlı olmuştur. Burada embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli canlı görüntüleme için bir protokol mevcut. Biz set zaman noktalarında çoklu numunelerin görüntüleri yakalamak için kapasitesine sahip standart bir CO 2 inkübatör içinde otomatik bir mikroskop sistemi kullanın. Sistem, bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop oluşur. Numuneler, her bir zaman noktasında çok sayıda örneğin görüntüleme sağlayan döner bir kürsü yerleştirilir. Aydınlatma, görüntü yakalama ve kürsünün dönme Metamorph yazılımı aracılığıyla işletilen otomatik bir sistem tarafından kontrol edilir. Işletim yazılımı kullanarak bir görüntüleme rutin ayarlayarak biz tw kadar aday için bir deney ayarlayabilirsinizen az insan müdahalesi ile o hafta. Bu örnekte biz özellikle büyük ölçekli büyüme ve koklea yeniden düzenlenmesini ve, prosensory bölgeyi göstermek için hem parlak bir alan ve floresan kullanın. Bu deneyde, cochleae. Embriyonik gün E13 üzerinde Sox2 EGFP muhabiri fareler disseke edilecektir In vitro kültürler kurulacak ve daha sonra beş gün içinde görüntülendi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Burada canlı embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli time-lapse görüntüleme için bir yöntem mevcut. Yaklaşık on gün boyunca memeli koklea gelirlerinin son derece düzenli, kompleks bir yapı oluşturmanın sorumlu gelişimsel programı. Bu süre boyunca gen ifadesindeki değişiklikler ve farmasötik veya genetik manipülasyona tepkilerini incelemek amacıyla, uzun dönemli görüntüleme gereklidir. Daha önce, canlı görüntüleme tipik olarak, standart bir mikroskop üzerinde bir nemlendirilmiş oda içinde Çıkarılan dokunun yaşayabilirliği ile sınırlandırılmıştır. Nem ve sıcaklık açısından Kültür büyümesi için gerekli ideal koşulları altında güçlüğü görüntüleme deneyleri uzunluğuna sınırları vermiştir. Değiştirilmiş bir doku kültürü inkübatör entegre bir mikroskop uzun vadeli-canlı görüntüleme için mükemmel bir ortam sağlar. Bu yöntemde biz embriyonik fare koklear eksplantlar kurmak nasıl ve zaman atlamalı IMAGI yapmak için bir inkübatör mikroskop nasıl kullanılacağını göstermektedirng 5 gün boyunca tipik embriyonik gün (E) 13 koklear çıkarılması ve Sox2, koklea prosensory hücrelerin bir göstergesi, davranışını incelemek için parlak bir alan ve floresan mikroskopi her ikisini de kullanarak.

Burada bir montaj (Şekil 1) ve E13.5 üzerine kaplama eğer tipik bir organotipik koklear eksplant büyüyecek nasıl gösteren bir film (Şekil 2) göstermektedir. Bir Sox2 raportör fare prosensory bölge görselleştirmek için kullanılmıştır. Film koklea büyüme ve yakınsama ve uzantısı uğradığını göstermektedir, yeşil Sox2 etki lateral bölgede hücreler genişler çevreleyen doku olarak bölmek için görünmüyor. Bu Corti organı karakteristik b...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Görüntüleme.  Sunnybrook Research Institute.  Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Nörobilim

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Fareler serbestçe davranıyor uzun vadeli duyusal çatışma

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...