Protokol, viral enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceğini ve uyanık, kafa kısıtlamalı farelerde beyin hücrelerinin görüntülenmesi için bir kafatası penceresinin nasıl implante edileceğini açıklar. Bu yöntemin avantajı, nöronların ve astrositlerin yapısının ve aktivitesinin birden fazla seansta tekrar tekrar görüntülenebilmesidir. Bu yaklaşım, nörogelişimsel veya nörodejeneratif bozukluk modellerinde sinir hücrelerinin nasıl değiştirildiğini veya deneyime bağlı plastisitenin bozulup bozulmadığını belirlemek için kullanılabilir.
Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını kullanarak anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaksik bir çerçeveye sabitleyerek başlayın. Steril cerrahi aletler kullanarak, cildi ön dikişlerden bregmanın önünden lambda'ya posterioruna kadar kesin ve çıkarın. Steril boyutta 11 karbon çelik cerrahi bıçak kullanarak, kafatasındaki tüm bağ dokusunu hafifçe kazıyın.
Bir diş matkabı yardımıyla, kemiğin incelmesini bile kolaylaştırmak için kafatası kemiğini açıklığın ana hatları boyunca konsantrik daireler halinde kademeli olarak delin. Her eşmerkezli geçişten sonra, delinen alana bir damla veya iki salin ekleyin ve delme işlemine devam etmeden önce salinin en az 10 saniye oturmasına izin verin. Kafatasının yeterince inceltilmiş ve hareket ettiğini kontrol etmek için kafatası kemiğinin orta bölgesini ince forseps ile hafifçe itin.
Sondajın gerçekleştiği altta yatan vaskülatürün sağlam olduğundan ve kemiğin çatlamadığından emin olun. İnceltilmiş kemiğe minyatür 15 derecelik sivri uçlu bir bıçağı dikkatlice yerleştirin ve meydana gelebilecek kanamaları durdurmak için saline batırılmış jel köpüğü kesin ve kullanın. Forseps kullanarak, dura materine zarar vermemeye özen göstererek kemiği dikkatlice kaldırın ve çıkarın.
Enjeksiyon için, steril eğimli bir cam pipeti 20 mikrometrelik bir uçla virüs karışımıyla doldurun. Daha sonra pipeti beynin yüzeyine dokunmak için indirin ve katman 2/3 enjeksiyonları için 200 ila 300 mikrometre daha alçaltmaya devam edin. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemi kullanarak, basınç sisteme iki dakika boyunca 12 ila 15 kez enjekte edilir.
Kraniyal pencere implantasyonu için, kapak camını kafatasındaki açıklığın üzerine yerleştirin. Camın açıklığın üzerinde aynı hizada olduğundan emin olmak için forseps kullanın. Cam pencerenin kenarlarını kafatasına kapatmak için, cam yüzeyin çevresine siyanoakrilat yapışkan jel uygulayın.
Yapışkan jelin üzerine bir yapıştırıcı tabakası uygulayın. Sonra bir kat diş çimento sıvısı ekleyin. Diş çimentosu sertleştiğinde, helikopter tipi kafa plakasının orta açıklığının etrafına ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın ve uygun boyuttaki helikopter tipi kafa plakasını kapak camının üzerine yerleştirin.
Tutkalın kurumasını bekleyin. Diş çimento tozunu 1,5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne 0,1 mililitrelik işarete kadar ekleyin. Yedi ila sekiz damla hızlı sertleşen anında yapıştırıcıyı tozun içine karıştırın ve elde edilen karışımı, daha büyük bir açıklık oluşturmak için kesilmiş 19 gauge iğneli bir mililitrelik bir şırıngaya çekin.
Toz karışımını, her iki taraftan da sızana kadar helikopter çubuğunun yan deliklerinden enjekte edin. Kafa plakasını kafatasına sabitlemek için diş çimento yapıştırıcı karışımını maruz kalan kafatasının geri kalanına uygulayın. Fareyi beze sarın ve kafa plakasından havayla kaldırılan ev kafesinin kafa sabitleme koluna sabitleyin, ardından ev kafesini ışığa maruz bırakın.
15 dakikalık bir alışkanlık süresinden sonra, fareyi ev kafesinden çıkarın. Mikroskobun geniş alan modunu kullanarak, kolayca tanımlanabilen vaskülatür iki ila üç pozisyonunu seçin. Kan damarlarının görüntülerini kaydedin ve motor kontrolöründe görünen x ve y koordinatlarını kaydedin.
Nöronların sinaptik yapılarını ve astrositlerdeki GCaMP6f aktivitesini görüntüleyin. Temsili analizde, kranial pencerenin kalitesi, dendritlerin ve GCaMP6f eksprese eden astrositlerin günler boyunca tekrarlanan görüntülenmesi ile değerlendirildi. İyi bir pencerede, nöronal yapılar açıkça görülebilen dendritik dikenlerle net görünüyordu.
Görüntülemenin ikinci gününde iki yeni diken ortaya çıktı. Sadece bir omurga devam etti ve beşinci günde görülebiliyordu. GCaMP6f'yi farklı zaman noktalarında eksprese eden astrositlerde kalsiyum aktivitesi incelenmiştir.
Bir lokomotif nöbeti sırasında tüm hücreyi kapsayan küresel bir olaya tanık olundu. Bu protokolün iki kritik adımı, kemiğin çıkarılmasından önce kemiğin yeterince inceltilmesi ve kapak camının açıklığın üzerine uygun şekilde yerleştirilmesidir. Görüntüleme, nöronal ve astrosit yapısının ve fonksiyonunun öğrenme yoluyla nasıl modüle edildiğini belirlemek için görüntüleme sırasında veya yeni bir motor beceri öğrenmek gibi davranış sonrası davranışsal analiz ile birleştirilebilir.
