Tek moleküllü, protein kaynaklı floresan geliştirme, protein yapısal alt nüfusları ve konformasyonları incelerken, özellikle farklı yapısal alt nüfusların kararlı yerel yapılar hakkında rapor verdiği durumlarda, tek moleküllü FRET ölçümlerini tamamlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, boya etiketleme bölgesinin protein yüzeylerine olan çevresine göre bölgeye özgü farklı yapısal alt popülasyonları yakalamasıdır. Tek moleküllü, protein kaynaklı floresan geliştirme, farklı, lokal, yapısal alt nüfusları araştırmak için ilgi çekici herhangi bir biyomoleküler sisteme uygulanabilir.
Düşük proteinli bir bağlama tüpünde ölçüm tamponunda 25 picomolar Sulfo-Cy3 etiketli alfa-sinüklein hazırlayarak başlayın. 18 odalı mikroskopi kapak kaydırasına mililitre başına bir miligramlık 100 mikrolitre ekleyin ve bir dakika kuluçkaya yatırın, ardından BSA'yı atın. Kapak kayması slayt odasına 25 pikolar Sulfo-Cy3 etiketli alfa-sinüklein örneğinden oluşan 100 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, veri toplama için, yüksek sayısal diyaframlı su daldırma objektif lensinin üstüne bir damla ultra saf su ekleyin, kapak kayması kaydıramasını sahne odasına sabitleyin ve ardından montajı mikroskop aşamasının üstüne takın. Kapak kayması kaydırağındaki objektif lensin üstündeki su damlası sürtünene kadar objektif lensi yukarı getirin ve lazer deklanşörü açın. Objektif lens yukarı doğru hareket ettiğinde, ccd kameradaki havadar halkaların desenini inceleyin.
İlk halka su/cam ara uzayını, ikinci halka ise cam ve numune çözeltisi arasındaki arayüzdeki odağı temsil eder. Lazer odağını kapak fişinin cam yüzeyinden gelen otofluoresansı en aza indirmek için çözeltinin derinliklerine getirmek için objektif lensin yüksekliğini 75 mikrometre artırın. Objektif lensteki lazer gücünü yaklaşık 100 mikrowatt ayarlayın.
Önceden tanımlanmış bir süre için algılanan fotonların alımını başlatın. Jupyter Not Defterleri'ni açın ve ardından örnek not defterini açın. FRETBursts ve Photon-HDF5 veri dosyasını yükleyin.
Her 30 saniyelik veri toplama için arka plan hızlarını hesaplamak için interfotoğraf zamanlarının histogramını kullanın. Ardışık 20 foton için aynı anda bir foton zaman penceresini taşıyın ve anlık foton oranı F, veri toplama döneminin arka plan hızından en az 11 kat daha büyükse foton verilerini toplayın. Bir patlamadaki fotonların patlama boyutunu ve miktarını, patlama süresini, bir patlamadaki son ve ilk foton algılama süreleri arasındaki zaman farkını, patlama parlaklığını, bir patlamada anlık foton hızının en büyük değerini ve patlama ayrımını, ardışık patlamalar arasındaki zaman aralığını hesaplayın.
Patlama parlaklığı değerlerinin histogramını logaritmik ölçekte olaylar ekseniyle çizin. Patlama parlaklığı eşiğini, histogramın çürüyen bir desen sergilediği minimum patlama parlaklık değeri olarak tanımlayın ve patlama parlaklık eşiğinden daha büyük parlaklık değerlerine sahip patlamaları seçin. Patlama ortalama floresan ömrü ölçümü için, seçilen patlamalardaki tüm fotonlar için foton nano zamanı histogramını logaritmik ölçekte foton sayım ekseni ile çizin.
Nanotime eşiğini, foton nanotimes histogramının çürüyen bir desen sergilediği minimum nano zaman değeri olarak tanımlayın. Yalnızca nanotime eşiğinden daha büyük nanotime'lara sahip fotonları seçin. Seçilen tüm foton nanotimes cebirsel ortalamasını hesaplayın.
Nanotime eşiğini foton nanotime cebirsel ortalamasından çıkarın. Elde edilen değer, ortalama floresan ömrü ile doğru orantılı olarak patlamanın ortalama foton nano zamanıdır. Tüm patlama ortalama floresan ömürlerinin histogramını çizin.
Floresan ömrünün merkezi olarak dağıtılmış alt nüfusları ortaya çıkabilir. Daha düşük değerli ortalamalara sahip alt nüfuslar, Sulfo-Cy3 ile sterik olarak engellenmemiş moleküler türleri temsil ederken, daha yüksek değerli ortalamalara sahip alt nüfuslar, S-Cy3 ile daha sterik olarak engellenmiş molekül türlerini temsil eder. Yavaş, patlama arası dinamikler değerlendirmesi için, patlama ayırma sürelerinin histogramını logaritmik ölçekte bir ayırma süresi ekseniyle çizin.
Aynı molekül alt nüfusunu tanımlayan maksimum ayırma süresinden daha az bir süreyle ayrılan ardışık patlamaların tüm çiftlerini kaydetmek için seçin. Belirli bir ayırma süresi eşiğinin altında yinelenen tüm patlama çiftleri için birinci ve ikinci patlamaların ortalama floresan ömürlerinin bir histogramını veya bir saçanı çizin. Tek bir S-Cy3 etiketli, alfa-sinüklein-56 molekülünün ortalama floresan ömürlerinin histogramları, ilk alt eğilimin 1,6 nanosaniyelik karakteristik bir floresan ömrüne sahip olduğunu ve kalıntı 56 civarında az protein yüzeyi olan alfa-sinüklein konformasyon durumlarını temsil ettiğini göstermiştir.
İkinci alt nüfus 3,5 nanosaniyelik karakteristik bir floresan ömrüne sahipti ve kalıntı 56 civarında daha fazla protein yüzeyine sahip alfa-sinüklein konformasyon durumlarını temsil ediyordu. Alfa-sinüklein moleküllerinin amiloid olmayan beta bileşen segmentlerinin, yaklaşık üç nanosaniye karakteristik ömrüne sahip tek bir floresan yaşam boyu popülasyonu ve karakteristik ömrü 1,6 nanosaniye olan subpopülasyonun yokluğu olarak doğrulanan SDS veziküllerine bağlanması üzerine sarmal, saç tokası yapısını benimsediği bilinmektedir. Ardışık, tek moleküllü patlamalar arasındaki ayırma sürelerinin histogramı, birinci ve ikinci patlamaların aynı molekülden kaynaklandığı 100 milisaniyeden daha hızlı ayırma süreleri için yinelenen molekülleri raporlar.
Tüm tek molekül patlamalarının ortalama floresan ömür histogramı, kısa karakteristik ömürle ve uzun karakteristik yaşam süresine sahip alt nüfuslar gösterdi, bu da bireysel moleküllerin patlama süresi sürelerinden daha yavaş farklı ortalama yaşam değerleri arasında geçişlere maruz kaldığını gösteriyor. En fazla 100 milisaniyelik patlama ayırma sürelerinde, kısa ömür alt nüfusta ilk patlama olarak başlayan ve uzun ömür altı nüfus içinde ikinci bir patlama olarak tekrarlanan moleküllerin bir kısmı vardı. Uzun ömürlü alt popülasyonda ilk patlama olarak başlayan ve kısa ömürlü popülasyon içinde ikinci bir patlama olarak tekrarlanan moleküllerin fraksiyonu, iki alt popülasyon arasındaki geçişleri 10 ila 100 milisaniye içinde gösterir.
Deneysel sonuçları analiz ederken hatırlanması gereken en önemli şey, tek moleküllü floresan sinyallerini arka plandan düzgün bir şekilde ayırmak ve patlamaları yeterli foton nanotimes ile analiz etmektir. smPIFE'nin geliştirilmesi, araştırmacıların nükleik asit protein etkileşimlerini tek molekül düzeyinde keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu ilerleme, proteinler içindeki yerel yapısal dinamikleri incelemek için zemin hazırlar.
