Matthew Blosser'a değerli tartışmalar ve tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deniz Araştırmaları Ofisi (N00014-16-1-2382) ve Ulusal Bilim Vakfı (PHY-1915017) tarafından desteklendi.

1. Protein etiketleme
<ol><li>NHS-Rhodamine, 5-HT1A membran parçaları ve bir adet 7 K MWCO spin tuzdan arındırma kolonunun oda sıcaklığında dengede olmasını sağlar.</li>
	<li>100 μL dimetil sülfit (DMSO) içinde 1 mg NHS-rhodamin çözün.</li>
	<li>pH 8'e 5-HT1AR çözeltisinin pH'ını artırmak için 5 μL 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>5-HT1AR çözeltisinin 50 μL'sine 3,66 μL NHS-rhodamin çözeltisi ekleyin ve pipet bir mikrosantrifüj tüpünde hafifçe yukarı ve aşağı. NOT: NHS-rhodamine'nin en az 10x azı dişi fazlalığına sahip olduğundan emin olun.</li>
	<li>Karışımı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca rotatora koyun.</li>
	<li>7 k MWCO spin sütununu 200 μL 1x fosfat tampon salin (1x PBS) ile üç kez 1,5 RCF'de 1,5 RCF'de yıkayın.</li>
	<li>Etiketli proteini bir sütuna ekleyin ve başka bir mikrosantrifüj tüpündeki miktarı dengeleyin.</li>
	<li>Etiketli proteini 1,5 RCF'de 5 dakika boyunca bir kez aşağı çevirin.</li>
	<li>280 nm ve 554 nm'de bir nanodrop spektrofotometre kullanarak bir UV-vis spektrumu alın ve üreticinin el kitabını izleyerek etiketleme verimliliğini hesaplayın.</li>
	<li>Etiketli proteini 5 °C'de bir sonraki kullanıma kadar saklayın. Çözelti etiketlemeden sonra yaklaşık bir hafta boyunca kararlıdır.</li>
</ol>2. Membran dahil 5-HT 1A ile GUV'ler
<ol><li>Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
	<ol>
<li>Proteinin, lipitlerin ve BSA'nın (Sığır serum albümini) oda sıcaklığına eşdeğer hale girmesine izin verin.</li>
		<li>Bu süre zarfında, kapakları metanol içine yerleştirerek ve 40 ° C'de 30 dakika sonicating yaparak temizleyin. Metanol kapakları tamamen kaplar ve su banyosundaki su seviyesinin kaptaki metanol seviyesinin üzerinde olduğundan emin olun. NOT: Metanol toksiktir ve uygun kimyasal başlıkta ele alınmalıdır.</li>
		<li>Kapaklardaki fazla metanolleri yumuşak bir hava akışı ile kurulayın. Fazla kapak örtülerinin kurumasını sağlamak için kapak rafını 40 °C fırında 15 dakika boyunca yerleştirin.</li>
		<li>Plazma temizleme işlemine başlayın. İlk olarak, kapakları plazma temizleyicisine yerleştirin ve odanın içindeki tüm havayı boşaltmak için hava giriş vanasını kapatın.</li>
		<li>Oda vakum altında kaldıktan sonra, kapakları yüksek RF güç ayarı ve neredeyse tam bir vakum kullanarak 5 dakika boyunca temizleyin, vakum odasına sadece hafif bir hava girişi ile. Uygun plazma seviyesini sağlamak için, vakum odasının açılmasını plazmanın elde ettiği rengin sabit, parlak pembe olacak şekilde ayarlayın. NOT: Hava kullanırken plazmanın plazma tedavisi adımı süresince parlak pembe bir renk olarak kalması çok önemlidir, çünkü daha koyu mor bir renk odada yanlış miktarda hava olduğunu ve yetersiz plazma tedavisine neden olacağını gösterir.</li>
		<li>5 dakika geçtikten sonra RF gücünü kapatın ve vakumun serbest bırakılmasını kesin. NOT: Plazma odasından çıkarıldıktan sonra lütfen kapak örtülerinin kapalı kaldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Hidrojel hazırlama
	<ol>
<li>6 mg ultra düşük erime sıcaklığında agarose ile 300 μL ultra saf su (yani% 2 (w/v) agarose) ile birleştirin. NOT: Proteinsiz GUV'ler yapmak için % 2 agarose kullanılacaktır. Agarose çözeltisi iki gün boyunca 45 ° C'de tutulabilir.</li>
		<li>9 mg ultra düşük sıcaklık agarose'u 300 μL ultra saf su ile 3 w/v agarose için 3.1 adımda hazırlandığı gibi birleştirin. Protein içeren GUV'lar yapmak için% 3 agarose kullanılacaktır.</li>
		<li>Vortex çözeltisini 90 °C ısı bloğuna yerleştirmeden önce 10 dakika boyunca kısa bir süre. Daha sonra, tüpü daha fazla kullanıma kadar erimiş formda tutmak için 45 ° C ısı bloğuna aktarmadan önce tekrar girdaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Agarose ve protein karıştırma
	<ol>
<li>%3 agarose'un 21 μL'sini 7 μL 5-HT1AR membran parçalarıyla karıştırın. Pipet yeterli karıştırma sağlamak için birçok kez yavaşça yukarı ve aşağı. Ardından, 45 °C'de 1 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hidrojel ve lipid birikimi
	<ol>
<li>Protein içermeyen GUV'lar için: %2 agarose'un 20 μL'sini kullanarak taze plazma ile temizlenmiş kapaklar üzerinde ince bir film yapın. Agarose damlacığın üzerine hızlı bir şekilde başka bir kapak kapağı bırakın ve her iki kapakta ince bir film yapmak için kapak kapaklarını hafifçe kaydırın. NOT: Bu adım, agarose hala erimiş formdayken damlacık kaymasının gerçekleşmesi gerektiği için zordur.</li>
		<li>Protein içeren GUV'lar için: Protein/ agarose karışımını bir kez daha yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından plazma ile temizlenmiş bir kapak parçasına% 2 agarose'un 20 μL'sini biriktirin. Yukarıda açıklandığı gibi kayma döküm talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Agarose'un oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunmasına izin verin.</li>
		<li>Lipitleri agarose tabakasının üzerine damla damla yatırın. 0.4 Mol% 1,2-Dipalmitoyl ile 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin (POPC) toplam 10 μL 2 mg/mL kullanın agarose filminin üstünde kloroform olarak ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (veya ilginin lipid karışımı) ile etiketlenmiş sn-glisero-3-fosfotanolamin (DPPE). Damlacıkları bir gaz kromatografi iğnesi kullanarak biriktirin ve hafif bir hava akımı aracılığıyla bir seferde bir damlacık yayın. NOT: Hidrojel üzerine nispeten düzgün bir lipit tabakası yapmak için bu adımda dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, kloroform toksiktir ve uygun kimyasal başlıkta ele alınmalıdır.</li>
		<li>Sykes-Moore (S-M) odalarını kapak kapağının üzerine bir O-halkası yerleştirerek ve ardından odanın üst bileşenini O-halkasının üzerine yerleştirerek monte edin. Hazneyi kapatmak ve herhangi bir sızıntıyı önlemek için hazne bileşenlerini birbirine vidalayarak hazneyi monte etmek için üretici tarafından sağlanan anahtarı kullanın. NOT: Odanın üst kısmı O halkasında sıkılmalıdır, ancak O-ring haznede düzgün oturmazsa kapak kapağı çatlayabilir diye kapak kapağının sağlam kalmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, şişkinlik çözeltisi eklendiğinde odanın sızmayacağı kadar sıkı bir şekilde kapatıldığından emin olun. Haznenin yeterince sıkılaştırılmaması sızıntılara ve numune kaybına neden olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Veziklin şişmesi ve hasadı
	<ol>
<li>1x PBS'de 450 μL 200 mM sakkaroz borusunu hafifçe pipetleyarak ve hidrojel lipit katmanlarının yeterli tampon kapsamını sağlamak için odalara hafifçe dokunarak tüm sistemi nemlendirin. NOT: Sakkaroz çözeltisi, biyolojik problar içeren bir rehidrasyon tamponu ile değiştirilebilir.</li>
		<li>Odaları 45 °C'ye yerleştirin ve buharlaşmayı önlemek için odanın üst kısmını bir kapakla örtün. Numunenin şişmesine izin verin, 1 saat boyunca enkaz ve ışıktan korunun.</li>
		<li>Kullanılması amaçlanan 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna ultra saf suya 100 μL 1 mg/mL BSA ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Ultra saf suyla üç kez ve 1x PBS'de 200 mM sakkarozla bir kez yıkayın.</li>
		<li>Son olarak, GUV örnek çözeltisi eklenene kadar 1x PBS'de 200 mM glikoz ekleyin. NOT: GUV adsorpsiyonun engellenmesi için BSA kullanılmıştır.</li>
		<li>Hidrojel şişmesine izin verdikten sonra, hidrojel yüzeyine bağlı kalabilecek HERHANGI bir GUV'yi yerinden çıkarmak için odayı hafifçe sallayın ve dokunun. Ardından, GUV-sakkaroz çözeltisini dikkatlice pipetle. NOT: Tüm veziklinlerin yüzeyden ayrılmasını sağlamak için isteğe bağlı bir adım olarak, sakkaroz süspansiyonunun bir kısmını hidrojel yüzeye hafifçe borulayın.</li>
		<li>Süspansiyonu, 1x PBS'de 700 μL 200 mM glikoz içeren daha önce hazırlanmış bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. NOT: Yoğunluk gradyanı, veziklitlerin santrifüj tüpünün dibine yerleşmesine yol açacaktır.</li>
		<li>Veziklilerin mikrosantrifüj tüpünün dibine batmasını sağlamak için veziklinlerin bir saat daha yerleşmesine izin verin ve optimum toplama için izin verin.</li>
		<li>GUV'ların glikoz içine yerleştirilmesinden sonra, konfokal mikroskop altındaki veziklileri incelemek için santrifüj tüpünün altından (yerleşik veziklinler) daha önce hazırlanmış ve BSA ile işlenmiş 96 kuyu plakasına 300 μL aktarın. NOT: Son numunede toplanan döküntü miktarını en aza indirmek için mikrosantrifüj tüpünün en altından kaçındığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroskop altındaki örnekleri kontrol edin.
	<ol>
<li>Numuneye 488 nm lazer parlatın (bu, bilayer ATTO-488-DPPE ile etiketlenmiş olduğu için zarı görselleştirmemizi sağlar).</li>
		<li>Numuneye 561 nm lazer parlatın (NHS-Rhodamine ile etiketlenmiş olduğundan proteini görselleştirmemizi sağlar). NOT: Fotooksidasyon veziklin dengesini bozabileceğinden numuneyi görüntülemede dikkatli olunması gerekir. Aynı gün vesicles gözlendi.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62830/62830fig01.jpg"> Şekil 1: Ayrıntılı protokol adımlarının çizimi. BioRender.com ile oluşturuldu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62830/62830fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Genel protokolün başarısı için kritik olan iki adım belirledik: plazma tedavisi ve lipid birikimi. Kapak kapaklarının plazma temizliği, agarose hidrojelinin cam kapak kapağına yeterli kapsama alanı ve yapıştırılmasının sağlanmasında esastır. Plazma temizliği iki şeyi gerçekleştirir: birincisi, cam yüzeyinden organik madde izlerini temizler; ikinci olarak, kapak yüzeyini aktive eder, cam yüzey hidrofilizliği arttıkça ıslanabilirlikte bir artış sağlar62,63</su...

Sentetik model membranlar, biyomembranların temel özelliklerinin ve işlevlerinin araştırılmasında güçlü araçlardır. Dev unilamellar veziküller (GUV'ler) çeşitli plazma membran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve farklı fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmış olabilir1,2,3,4,5,6,7,8. Plazma membranının ve organizasyonunun sinyal transdüksiyonu, yapışıklık, endositoz ve transport9,10,11,12,13,14,15 gibi çok sayıda hücresel işlemde kilit rol oynadığı iyi belirlenmiştir.
GUV'lar nazik hidrasyon16, hidrojel şişme17, elektroformasyon18, mikroakışkan teknikler19,20,21,22, jetting23 ve solvent değişimi24,25,26 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak üretilmiştir. İntegral membran proteinlerinin (IMP) işlenmesindeki zorluklar nedeniyle, bunları incelemek için in vitro platformlar sınırlı olmuştur. GUV'ler, IMP'leri yerel ortamlarını taklit eden bir ortamda incelemek için basitleştirilmiş bir platform sunar. GUV'lerde protein rekonsesi için çeşitli yaklaşımlar olmasına rağmen, proteinlerin doğru oryantasyonla birleştirilmesi ve protein işlevselliğinin korunmasından kaynaklanan zorluklar ortaya çıkmaktadır27.
GUV'larda en başarılı protein rekonsesi deterjan değişim yöntemini gerektirir; proteinlerin deterjanlarla kendi çevrelerinden çözünür hale getirilmesini, ardından protein saflaştırılmasını ve daha sonra deterjan moleküllerinin çeşitli yöntemlerle lipitlerle değiştirilmesini içerir28. Deterjanlar saflaştırma sırasında IMP'lerin üçüncül yapısını stabilize etmeye hizmet ederken, deterjan miselleri lipid bilayers28,29,30'da özellikle fonksiyonel çalışmalar için daha iyi stabilize edilen bu proteinler için nispeten doğal olmayan bir ortamdır. Ayrıca, geleneksel GUV imalat teknikleri kullanılarak fonksiyonel transmembran proteinlerinin lipid bilayer içine dahil edilmesi, bu proteinlerin büyüklüğü, inceliği ve ihtiyaç duyulacak ek deterjan değişim adımları nedeniyle zor olmuştur27,31,32,33. Deterjanları çıkarmak için organik çözücü kullanımı protein toplama ve denatüre edilmesine neden olur34. Geliştirilmiş deterjan aracılı bir yöntem umut vericidir, ancak deterjan giderme adımı için dikkatli olunması ve belirli proteinler için optimizasyon gerekebilir31,35. Ek olarak, elektroformasyon kullanan yöntemler protein seçimini kısıtlayabilir ve özellikle yüklü lipitler için tüm lipit bileşimleri için uygun olmayabilir31,36,37. Kullanılan bir diğer teknik, istenen proteini içeren büyük unilameller vesicles'in (LUV) PEPTİD kaynaklı füzyonudur, ancak zahmetli olduğu ve yabancı moleküllerin yerleştirilmesine yol açabileceği bulunmuştur-fusojenik peptitler33,38,39. Canlı hücrelerden elde edilen dev plazma membran veziklikleri (GPMV'ler) bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için kullanılabilir, ancak ortaya çıkan lipit ve protein bileşiminin minimum kontrolüne izin verir14,40,41. Bu nedenle, modifiye agarose şişme yöntemimizi kullanarak IMP'lerin GUV'lerin bilipid tabakasına entegrasyonu, bu proteinleri membran ortamında daha fazla incelemek için güvenilir bir yöntem sürmektedir42,43,44,45.
Hücresel sinyalizasyon ve iletişim, G protein bağlantılı reseptörler (GPCR) olarak bilinen bir protein ailesini içerir; GPCR'ler en büyük protein ailesi arasındadır ve diğer birçok fizyolojik fonksiyon arasında ruh hali, iştah, kan basıncı, kardiyovasküler fonksiyon, solunum ve uyku modülasyonu ile ilişkilidir46. Bu çalışmada GPCR ailesinin prototipik bir üyesi olan insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) kullanıldı. 5-HT1AR merkezi sinir sistemi (CNS) ve kan damarlarında bulunabilir; kardiyovasküler, gastrointestinal, endokrin fonksiyonlar gibi çok sayıda işlevi etkiler ve mood47'nin düzenlenmesine katılır. GPCR araştırmalarının önündeki büyük bir engel karmaşık amfifilik yapılarından kaynaklanmaktadır ve GUV'lar protein işlevselliği, lipid-protein etkileşimleri ve protein-protein etkileşimleri gibi çeşitli ilgi çekici özelliklerin araştırılması için umut verici bir platform sunun. Yüzey plazmon rezonansı (SPR)48,49, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)50,51, protein lipid kaplaması (FKÖ) tahlil51,52,53,54, yerli kütle spektrometresi55, izotermal titrasyon kalorimetresi (ITC)56,57 ve lipozom sedimentasyon tahlil58,59. Laboratuvarımız, reseptörün aktif durumunda Giα alt birliğine bağlanan BODIPY-GTPφS'yi yalıtarak lipid-protein etkileşimlerinin protein işlevselliği üzerindeki etkisini araştırmak için basitleştirilmiş GUV yaklaşımını kullanmıştır. Bağlamaları, zaman içinde tespit edilebilen bir floresan sinyali üreten floroforu çözer45. Ayrıca, çeşitli çalışmalar Lipid-protein etkileşimlerini ve proteinlerin membran eğriliğini algılama veya stabilize etmedeki rolünü araştırdı60,61 ve uygulanabilir bir GUV yaklaşımı kullanmak önemli bir avantaj olabilir.
Bu protokol, modifiye edilmiş bir agarose hidrojel sistemi17,42 kullanarak GPCR'leri GUV'lerin membranına dahil etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Ayrıca, önceki çalışmalarımıza dayanarak, yöntemimiz 30-40 ° C'ye kısa süreli maruz kalabilen IMP'ler için uygun olabilir. Kısaca, ilgi GPCR'sini içeren membran parçalarıyla birlikte ince bir agarose filmi yaydık. Bu tabakanın jelasyonunu takiben, agarose üzerine bir lipit çözeltisi biriktiriyoruz ve çözücüyün buharlaşmasını sağlıyoruz. Sistemin yeniden sulanması daha sonra sulu bir tampon ile gerçekleştirildi ve lipid bilayer'e dahil protein içeren GUV'lerin oluşumuna neden oldu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850375C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;TI-Eclipse inverted microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850355C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13/16&#8243; ID, 1&#8243; OD silicon O-rings</td>
			<td>Sterling Seal &#38; Supply, Neptune, IN</td>
			<td>5-003-8770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera</td>
			<td>Photometrics, Huntington Beach, CA</td>
			<td>&#160;Cascade II 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850457C-25mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm</td>
			<td>Coherent, Santa Clara, CA</td>
			<td>488/561-50-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-HT1AR membrane fragments</td>
			<td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td>
			<td>RBHS1AM400UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)</td>
			<td>ATTO-TEC, Siegen, Germany</td>
			<td>AD 488-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform (CHCl3)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>CX1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (Chol)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>C8667-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well Flat Clear Bottom</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic</td>
			<td>Elma, Singen, Germany</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Millipore Sigma, Burlington, MA</td>
			<td>MX0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-Rhodamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spinning-disc CSUX confocal head</td>
			<td>Yokogawa,Tokyo, Japan</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard 25 mm no. 1 glass coverslips</td>
			<td>ChemGlass, Vineland, NJ</td>
			<td>CLS-1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sykes-Moore chambers</td>
			<td>Bellco, Vineland, NJ</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low melting temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Analog Heatblock</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>[no longer sold on main website]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Tube Rotator</td>
			<td>VWR International, Radnor, PA</td>
			<td>10136-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of model lipid membranes incorporating g-protein coupled receptors (gpcrs)

İntegral membran proteinlerinin yapısı ve işlevinin sağlam in vitro incelemeleri, plazma zarının karmaşıklığı ve canlı hücrelerde protein davranışını etkileyen çok sayıda faktör nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar vesicles (GUVs), protein-membran etkileşimlerini araştırmak ve protein davranışını kesin, uyarana bağlı bir şekilde araştırmak için biyomimetik ve yüksek oranda tonlanabilir bir in vitro model sistemidir. Bu protokolde, membrana saplanmış insan serotonin 1A reseptörü (5-HT1AR) ile GUV'ların üretimi için ucuz ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Modifiye hidrojel şişme yöntemi kullanarak GUV'lar imal ediyoruz; agarose ve 5-HT1AR karışımının üzerine bir lipid filmi biriktirerek ve daha sonra tüm sistemi nemlendirerek, membran içine dahil edilmiş düzgün yönlendirilmiş ve fonksiyonel 5-HT1AR ile vezikliler oluşturulabilir. Bu GUV'lar daha sonra mikroskopi ile protein-membran etkileşimlerini ve lokalizasyon davranışını incelemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, derin fizyolojik içgörü sağlayarak integral membran proteinlerinin işlevselliği hakkındaki anlayışımızı ilerletebilir.

Protein konsantrasyonu ölçüldü ve etiketleme derecesi boya ile protein arasındaki azı dişi oranı olarak 1:1 olarak hesaplandı. Konfokal mikroskopi kullanarak GUV'ları inceleyerek veziklin başarılı oluşumunu ve protein entegrasyonunu doğrulayabildik. Lipitler %0.4 atto 488-DPPE ile etiketlendi ve protein rhodamine NHS-ester birincil aminlerin modifikasyonu ile birlikte etiketlendi. Şekil 2a ve Şekil 2b sırasıyla ATTO 488 ve rhodamin kanalların...

Watch this Scientific Journal Video about Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs at JoVE.com

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

Bu protokol, farmakolojik olarak önemli G proteini bağlantılı reseptör sınıflarından biri olan insan 1A serotonin reseptör proteininin (5-HT1AR) yeniden uzlaştırılması için burada açıklandığı gibi, integral membran proteinlerini (IMP'ler) dev unilamellar lipid veziküllerine (GUVs) dahil etmek için güçlü ve genelleştirilebilir bir teknik olarak agarose şişmesini kullanır.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

İntegral membran proteinlerinin kendi ortamlarında incelenmesi, plazma zarının karmaşıklığı nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar lipid vezikülleri veya GUV'lar, biyomembran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve çeşitli fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol, hidrojel şişmeden sonra, spontan bir bütünleşmeye dayalı protein dahil GUV'ler imal etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. GUV'leri imal etmek için geleneksel yöntemler integral membran proteini birleştirilmesi için genelleştirilemez. Bu yöntemler genellikle düşük verim, metodolojik olarak karmaşık ve geçicidir, geniş protein sınıfları için geçerli değildir. Öte yandan, bu protokol GUV'larda fonksiyonel integral membran proteinlerini dahil etmek için esnek, sağlam ve basit bir yöntemi temsil eder.Bunu, proteini içeren bir hidrojel iskele hazırlayarak ve üzerine ince bir lipit tabakası biriktirerek başardık. Burada sunulan örnekte, G protein bağlantılı reseptör veya GPCR'yi GUV'lara dahil ettik.Tüm sistemin yeniden sulanması üzerine, GUV'lar hidrojel yüzeyinden düzgün yönlendirilmiş GPCR'ler içeren membranla tomurcuklandı.Tüm reaktiflerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Bu süre zarfında, kapak kaymalarını metanol içine yerleştirerek ve 40'ta 30 dakika sonicating yaparak temizleyin

construction-model-lipid-membranes-incorporating-g-protein-coupled

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

3.4K Görüntüleme.  University of Southern California. İntegral membran proteinlerinin kendi ortamlarında incelenmesi, plazma zarının karmaşıklığı nedeniyle zor olmuştur. Dev unilamellar lipid vezikülleri veya GUV'lar, biyomembran özelliklerini incelemek için en belirgin platformlardan biridir ve çeşitli fizyolojik durumları taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol, hidrojel şişmeden sonra, spontan bir bütünleşmeye dayalı protein dahil GUV'ler imal etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. GUV'leri imal etmek içi...