Bu protokol, hücre çekirdeğinin hücre polarizasyonu, farklılaşması ve geçişi için mekanik bir ölçer haline getiren bireysel mekanik özelliklerini parçalara ayırır. Bu tekniğin ana avantajı, mekanik özellikleri ölçebilmesi ve membranın veya kortikal sitoskeletonun dış pertürbasyonu olmadan hücre altı bölmelere kuvvet uygulayabilmesidir. Protokol, farklı hücre hatlarındaki veya hayvan modellerindeki nükleer mekaniği incelemek için diğer organizmanın diğer hücrelerinin içindeki boncukları manipüle etmek için kolayca uyarlanabilir.
Optik tuzakları oluşturan ve bırakan tüm ışığı yakalamak için doğrudan kuvvet sensörünün hizalanması önemlidir. Bu, bir hücrenin viskoelastik ortamında doğru ışık momentumu ölçümleri sağlayacaktır. Küre evre embriyolarını döllenmeden dört saat sonra plastik bir Pasteur pipet kullanarak E3 ortamı içeren bir cam tabağa yerleştirerek tek hücreli hazırlamaya başlayın.
Daha sonra boncuklara pozitif olan embriyoları seçin ve mRNA enjeksiyonu durumunda floresan proteini ifade edin. Embriyoları manuel olarak decurionize etmek için uzunlayıp cam pastör pipet yardımıyla yaklaşık 10 ila 15 deklerionlu embriyoyu 1,5 mililitre reaksiyon kabına aktarın. E3 ortamını tüpten çıkarın ve önceden ısıtılmış 500 mikrolitre önceden ısıtılmış karbondioksitten bağımsız doku kültürü ortamı ekleyin.
Kabarcık oluşumunu önleyen tüpü hafifçe sallayın ve hücreler gözle görülebilen büyük parçalar olmadan ayrıştıkça tüpün içeriğinin bulanık hale gelmesini sağlayın. Daha sonra tüpü üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre boyamaya devam etmek için peletin toplayın.
Çekirdeği etiketlemek için, tüpe yeni hazırlanmış DNA Hoechst boya boyama çözeltisinin 500 mikrolitresini ekleyerek hücreleri yeniden biriktirin. Lekeli hücreleri karanlıkta yedi dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra, hücreleri daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin ve peleti süspansiyondaki numuneler için 50 mikrolitre DMEM'de veya hapsedilen hücreler için 20 mikrolitre DMEM'de yeniden biriktirin.
Süspansiyondaki hücrelerle yapılan deneyler için optik bindirmelerin veya OT odasının hazırlanması için, merkezde yaklaşık 10 milimetre ile 10 milimetre kare delikli bir çift taraflı viski bandı parçası kesin. Bandın koruyucu katmanlarından birini soyun ve bandın açık tarafını 1,5 H cam alt kabın ortasına yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınırken bandın tüm yüzeyini cama yapıştırmak için bandı hafifçe bastırın ve bandın kalan koruyucu tabakasını soyun.
Yüzeyi 30 dakika boyunca mililitre başına 0,5 miligramda 100 mikrolitre Concanavalin A ile kuluçkaya yatırın. Ardından Concanavalin A damlasını çıkarın ve yüzeyi DMEM ile durulayın. Hücreleri içeren çözeltinin 30 mikrolitresini boşluk yüzeyine ekleyin.
Daha sonra odayı 22'ye 22 milimetrelik bir kapak camı ile çok nazikçe kapatın. Gerekirse neşter veya nesle kullanın. Ardından, çıkış gücü kararlılığını optimize etmek için deneyden önce en az 30 dakika boyunca lazeri önemli ölçüde yüksek güçte açarak optik cımbız başlangıcına devam edin.
Bittiğinde, optik mikro manipülasyon ve kuvvet ölçüm ünitelerinin elektronik modülünü açın. Optik kuvvet sensörunu hizalamadan önce, 60X 1.2 su daldırma hedefine bir damla su koyun ve hücreleri içeren odayı sahneye yerleştirin. Hücre örneklerinin yerleştirileceği odanın alt yüzeyine odaklanın.
Numuneyi kaplayan kapak camı kaydırağı üzerine bir damla daldırma yağı ekledikten sonra, kuvvet sensörü ünitesinin toplama lensini yağ damlacığını temas edene kadar küt küt küt bırakın. Optik kuvvet sensörü hizalaması için standart prosedürü izleyerek, OT'leri konumlandırmak için kullanılacak yardımcı kameradaki örnek düzlem görüntüsüne bakın, ardından alan durdurması örnek düzleme konjuge edilene kadar optik kuvvet sensörünü kübünleyin. Bertrand lens ile hava kabarcıklarını kontrol etmek için yardımcı kameradan görüntüleme yolunu gözlemleyin.
Herhangi bir kir veya hava kabarcığı görünürse, prosedürü açıklandığı gibi tekrarlamadan önce lensi ve hazneyi tozsuz lens dokusuyla temizleyin ve daha fazla daldırma yağı ekleyin. Optik kuvvet sensörünün tutucusuna yerleştirilen yanal vidaları kullanarak, alan durağını görüş alanına ortalayın. Doğruluk için, yardımcı kamerada görülebilen görüş alanını neredeyse işgal etmek için alan durağını açın.
Numuneyi mikroskop içine yerleştirdikten ve optik kuvvet sensörini hizaladıktan sonra, çekirdeğin sertliği veya araştırılan hücreler arası yapı bilinmiyorsa, ilk tuzak gücünü 200 miliwatt'a ayarlamak için dönen yarım dalga plakasını kullanın. Tamamlandığında, iletilen Brightfield mikroskopisi aracılığıyla bir veya iki boncuklu bir hücre aramak için mikroskop aşaması yazılım denetleyicisini kullanın. Sayısal sayfaya, sonraki her yörünge adımının ötelemesini ve zamanını yazın.
Alternatif olarak, ek malzemeden S1 tablosunu yükleyin. Stres/gevşeme deneyi için uygulanacak yamuk yükleri programla. OT yazılımında optik tuzakları etkinleştirin.
Bir mikro küreyi bindirme için, görüntü düzlemlerini bir mikroskop aşaması yazılım denetleyicisiyle boncuk üzerinde biraz ayarlayın. Kalibre edilmiş yardımcı kamera görüntüleme penceresindeki polistiren mikrobead üzerine tıklayın. Boncukların optik tuzak tarafından başarılı bir şekilde hapsedilmesi, boncuk hareketini güçlü bir şekilde azaltacaktır.
Tıklayın ve boncuk sitoplazm boyunca sürükleyin ve nükleer zarftan yaklaşık iki mikron mesafeye yerleştirin. Yörüngenin boncuk girintisinin nükleer zara dik olacak şekilde ayarlı olduğundan emin olun. Kurulum hazır olduğunda, görüntüleme yazılımına gidin ve görüntü alımını başlatmak için alma düğmesine tıklayın.
Gerçek zamanlı kuvvet okuma penceresini açın, verilere tıklayın ve kaydetmek için gerçek zamanlı kuvvet okuma penceresinde kaydedin. Tuzak konumunu başlatın ve ölçüm verilerini zorla. Boncuk üzerine sağ tıklayarak ve başlangıç yörüngesini seçerek önceden yüklenmiş yörüngeyi başlatın.
Bindirme kuvveti ölçüm verilerinin kaydını bitirmeden önce yörünge bitene ve sistem stabilize olana kadar bekleyin. Görüntü alımını durdurun ve işlem sonrası yazılımdaki sonuçları çizin. Temsili analizde, çekirdeğe yakın tek bir mikrokürece sahip izole bir zebra balığı progenitor kök hücresi görüntülenir.
Bir embriyonun içine enjeksiyondan beş saat sonra polistiren mikrosferin dağılımı izlendi. Brightfield ve floresan görüntü boncukların embriyo dokusuna dağıldığını gösteriyor. Konfokal floresan Z yığınının maksimum projeksiyonu ve aynı bölgedeki bir alt yığının maksimum projeksiyonu, derin hücrelerin büyük bir kısmının bir ila iki boncuk içerdiğini doğrular.
Döllenmeden 24 saat sonra boncuklar embriyonun tüm vücuduna dağıtıldı. Bir veya iki enjekte edilmiş boncuk ile sınırlı hücrelerdeki süspansiyon hücrelerinin Brightfield mikrografileri elde edildi. Ayrıca, birden fazla floresan etiket, hücreler arası membran, plazma membran, DNA ve transgenik çizgi gibi hücrelerin farklı yönlerinin araştırılmasını kolaylaştırdı.
Temsili anlık görüntüler, Hoechst etiketli çekirdekleri optik olarak sıkışmış bir mikrokürecikle girintiden beş saniye önce/sırasında ve girintiden beş saniye sonra tanımladı. Askıda ve kapalı hücrelerin girinti deneyi sırasında çekirdeğin distal ve proksimal sınırlarının üç farklı çerçevesi ve yörüngesi için girinti segmenti boyunca yoğunluk profilleri çalışılmıştır. Tekrarlanan bir nükleer girinti deneyi sırasında optik olarak sıkışan mikro kürenin yaşadığı sıkışmış yörünge ve kuvvet ölçüldü.
Süspansiyonlu ve hapsedilmiş hücrelerdeki çekirdek mekaniği, hapsedilmenin öngörülen alanın genişlemesine ve nükleer sertlikte önemsiz bir değişikliğe neden olduğunu doğruladı. Boncuklar bir hücre evresi embriyosuna enjekte edilirse, büyük olasılıkla sonraki aşamalarda eşit olarak dağıtılacaktır. Boncuk'un saplanarak tuzağa düşürülmesi gerektiğini unutmayın.
Boncuk optik tuzaktan kaçarsa, yörüngeyi yeniden tanımlayın veya lazer gücünü artırın. Bu deneyler bir hücrenin içindeki birden fazla mikrobead üzerinde kolayca gerçekleştirilebilir ve aktif mikrorheoloji ölçümlerine genişletilebilir.
