Bu protokol canlı embriyolarda hücre soylarının ve kimliklerinin etkin bir şekilde izlenmesini sağlarken, c.elegans nöronlarının geliştirilmesinde aksonlar ve dendritler gibi ayrıntılı hücre morfolojilerini de analiz eder. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, çift görüşlü ters selektif düzlem aydınlatma mikroskopisi veya diSPIM gürültüye daha yüksek sinyal, daha izotropik uzamsal çözünürlük sunar ve vivo görüntülemede uzun süreli için daha uygundur. Bir içbükey mikroskop slayt depresyon içine% 1 metilselüloz çözeltisi 500 mikrolitre ekleyerek başlayın.
Platin tel pick kullanarak, m9 metilselüloz çözeltisi içine bir nematod büyüme orta plaka yetişkin transfer. En az bir ila dört hücreli embriyolar için orta vücutta her hayvan enine dilim için 18 gauge hipodermik iğneler keskinleştirilmiş ipuçlarını kullanın. Dişler in arasında hafifçe tutulan bir aspiratör ağızlık ile, 10 ila 15 mikrolitre M9 tamponu ile mikrokapiller bir pipet ön doldurun ve yavaşça kapiller içine slayt birkaç embriyo aspire.
Embriyoları taze M9 tamponu yla dolu çelik bir görüntüleme odasının kapağının merkezi dikdörtgenine dağıtın. Embriyoları dikey olarak, her embriyonun uzun ekseninin örtünün uzun eksenine dik olması için yavaşça yönlendirin. Daha sonra çelik görüntüleme odasını bir diSPIM sahnesine numune tutucuya yerleştirin.
Embriyoları görüntülemeye hazırlamak için, mikro yöneticisi açın ve lazer yoğunluklarını 488 nanometre için %0,5 eşdeğerliğe ve 561 nanometre için %0,25 eşdeğerliğe ayarlayın. Belirli mikrowatt'ların kapsamını belirlemek için yazılım ayarı ve gerçek lazer çıkışı arasındaki kalibrasyon önceden yapılmalıdır. Eklentiler menüsünde, uygulanan bilimsel görüntüleme çift görünümlü ters selektif düzlem aydınlatma mikroskopisi penceresini açmak için cihaz kontrolü ve uygulamalı bilimsel görüntüleme diSPIM'i seçin.
Edinme sekmesialtında, parametrelerin belirtildiği gibi ayarlı olduğunu onaylayın. Otomatik netleme sekmesinin altında, parametreleri belirtildiği gibi ayarlayın. Otofokus kanalının planlanan hatlama deneyleri için nükleer floresan kanalını belirtmesi gerektiğini unutmayın.
A veya B yolu için ışın ve sayfa kutularını kontrol edin ve görüntü edinimi başlatmak için canlı'yı tıklatın. Canlı bir görünüm penceresi açılır. Sonra embriyo otofokus analiz bölgesiseçmek için ilgi embriyo etrafında bir kutu çizmek ve uzun vadeli çok boyutlu görüntü yakalama başlatmak için satın alma başlat'ı tıklatın.
Görüntü görüntüleme, işleme ve hücre soy analizi için, yazılım paketini indirip çıkardıktan sonra CytoSHOW'u çalıştırmaya başlamak için CytoSHOW_app. jnlp dosyasına çift tıklayın. Dosya menüsünün altında, ham mikro yönetici görüntülerinin kaydedildiği kök veri seti klasörünü bulmak için yeni ve diSPIM monitör mikro yöneticisini seçin.
Herhangi bir zaman noktası klasörünü seçin ve aç'ı tıklatın. Çok boyutlu navigasyon pencereleri hem SPIM A hem de SPIM B için otomatik olarak açılacaktır.Çokgen seçim aracını kullanarak, hem SPIM A hem de SPIM B görünümlerinde embriyo üzerinde papyon deseni oluşturmak için anterior, posterior, dorsal ve ventral kenarlarının hemen dışına tıklayın ve diSPIM'e tıklayın. Her SPIM kolu için yeşil ve kırmızı kanalları hizalayın ve diSPIM'i yeniden tıklatın.
Vardiyalar diğer tüm konum pencerelerinde tetiklenir. Ardından, deconvolved sigorta diSPIM ham veri hacimleri iletişim kutusunu açmak ve parametreleri belirtildiği gibi ayarlamak için diSPIM ve sigorta yı tıklatın. Tüm parametreler ayarlandığında, Evet'i tıklatın ve Tamam'ı tıklatmadan önce işlenen dosyaları kaydetmek için çıktı dizinini belirtin. Önizleme penceresinde, t kaydırma çubuğunu pencerenin ikinci noktasına taşıyın ve z kaydırıcısını doğrudan embriyonun uzun ekseni boyunca görünüm gösterilene kadar hareket ettirin.
T-scroll çubuğunu önizleme penceresindeki bir zaman noktasına geri taşıyın ve AB hücre metafaz plakalarının düzleminden ventral en yuvarlak çekirdeğinden bir çizgi çizmek için hat seçim aracını kullanın. İnce ayarlamaları önizleme hacminin yönü yle kaydetmek için diSPIM önizleme düğmesini tıklatın. diSPIM monitör pencerelerinin t kaydırma çubuklarını, işlenecek görüntülerin tam açıklığı olan başlangıç ve bitiş zaman noktalarına ayarlayın.
Ardından Tamam'ı tıklatın. Verimli ve doğru bir hücre soy analizi için Starry Night işlemeden önce veri hacimlerinin kesin bir ADL yönünü elde etmek çok önemlidir. AceTree Starry Night soy izleme serisi açmak için, sağlanan özelleştirilmiş AceTree dosyasını açın ve daha önce belirtilen çıkış dizini bulmak için dosyayı açık seçin. İlgi çeken embriyo için sigorta alt klasörünü açın ve düzenlenen dosyayı seçin.
Daha sonra aç'ı tıklatın ve daha önce açıklandığı gibi soy görselleştirme ve düzenleme ile devam edin. Optimize edilmiş protokoller, kuluçka zamanı ve gelişimsel kilometre taşlarına ilişkin zamanlama ya da kuluçka zamanına göre değerlendirildiği gibi embriyolara saptanabilir fototoksisite yapmaz. Bu protokolün gösterildiği gibi, nematod türünü ifade eden bu transgenik yeşil floresan proteindeki tanımlanamayan hücrelerin motor nöronlara, boşaltım kanalı hücresine ve iki kas hücresine karşılık olduğu belirlenmiştir.
Tanımlanan nöronlar oblik olarak erken şekilli edildi 360 dakika sonra döllenme uzun hücresel eksen ile nötrit büyüme için sonraki ekseni temsil eden. 385 ila 410 dakika sonra döllenme, RMDD nöritler hücre gövdelerinin yaklaşık altı mikrometre ön genişletti. 415 ila 445 dakika sonra döllenme, her iki nöritler içine ve varsayımsal sinir halkası etrafında dorsally uzattı.
Ortalama olarak, her RMDD neurite senkronize halkanın tepede kontralateral meslektaşı toplantı önce hücre vücudundan yaklaşık 11 mikrometre uzatıldı. Birlikte ele alındığında, bu veriler, tek tanımlanabilir hücreler için nöronal gelişimsel özelliklerin bu entegre protokol kullanılarak incelenebildiğini, karşılaştırılabildiğini ve ölçülebildiğini göstermektedir. Her embriyonun uzun ekseninin örtünün uzun eksenine dik olması için embriyoları dikey olarak yönlendirmeyi unutmamak önemlidir.
Bu protokolü kullanarak, yeni doğan embriyonik sinir sistemini her açıdan keşfetmeye başladık. Örneğin, hücre doğumu sırasında, göç ve farklılaşma, nötrit oluşumu, büyüme ve fasikülasyon.
