Name: preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy
Uploaded: 2015-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

NOT: Tıp Wake Forest Okulu Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır açıklanan protokol. Aydınlatılmış onam yazılı elde edilmiştir. Tüm katılımcılar 23-35 arasında değişen BYES ile, her iki cinsiyette sağlıklı yaşlı yetişkinler (65-79 yaş) idi. 1. İskelet Kası Biyopsi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi, 9 bir O / N hızlı sonra sabahın erken saatlerinde tüm biyopsi. Biyopsi öncesi hafta kanama, trombosit, ya da morarma etkileyebilir aspirin, reçete ve over-the-counter non-steroid anti-inflamatuar ilaçlar, ya da diğer bileşikleri almaktan kaçınmaları konular isteyin. Ayrıca biyopsi öncesinde en az 36 saat süreyle herhangi bir yorucu hareketlerden kaçınmalısınız isteyin. NOT: Kas% 1 lidokain ile lokal anestezi altında perkütan iğne ile perkütan iğne biyopsisi tekniği kullanılarak lateralis vastus elde edilir. Hiçbir tıbbi komplikasyon ya da other prosedürden advers olaylar klinik araştırma biriminde meydana gelmiş bildirildi. </li><li> NOT: tarif biyopsi işlemi Bergstrom 10 o uyarlanmıştır. <ol><li> Kısaca, yerel kas sızmak için% 1 lidokain alma bakım yönetmek. Yeterli uyuşturma izin için 10 dakika bekleyin dönemi ile bu izleyin. </li><li> Subfasiyal ve myotendonous alanları kaçınarak kas (ekleme ve menşe arasındaki kasın orta bölge) karnından biyopsi al. <ol><li> Perkütan iğne (pencere ve iç kesim silindiri kesme bir tarafı ile bir emme destekli yeniden cihaz) kullanın ve bir rehber olarak fasya bir fasiyal &quot;pop&quot; veya direnç izleyin. </li><li> , Anestezi iğnesi ile derinliğini tahmin sonra tekrar dar neşter bıçağı ile hissediyorum ve fasya ile 4-5 mm kesi yapmak. O kas içine sokulur kadar kesikten iğne Advance. </li><li> Toplamakpencere birden çok numune farklı yönlerde dönmektedir. Ilerleyen ve farklı yönlere perkütan iğne içine 2-4 kez kas örnekleri geri çekilirken bir 60 cc şırınga kullanarak sürekli emme uygulayın. Emiş durdurun ve iğneyi çıkartın. NOT: Her geçiş (ekleme ve iğne çıkarılması) bir dakikadan az sürer. </li><li> 5 dk hemostaz kurmak için bir asistan sitesine delinmeye firma baskı uygulayın var. Emme boru iğne ayırın ve dikkatle pencere ve varil kas örnekleri çıkarın. </li></ol></li><li> Daha fazla kas Yukarıdaki prosedürü tekrarlayarak gerekirse ikinci bir geçiş yapın. </li><li> , Forseps kullanarak kas örneğinden herhangi bir görünür kan pıhtıları çıkarın örneği tartmak ve hemen buz gibi soğuk DPBS içeren bir tüp yerleştirmek. NOT: Bu yöntemi kullanarak ortalama verim 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Mitokondriyal İzolasyon &lt;ol&gt; <li> Taze deneyde, ya alikotunun gününde Chappel-Perry (CP) ve Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) tamponları (Tablo 1) hazırlamak ve -20 ° C&#39;de saklayın. -20 ° C de, 2.5 mM konsantrasyonda ve tablet ve mağazada dimetil sülfoksit bileşikleri hazırlayınız. Hazırlama gününe 2 ay içinde -20 ° C sıcaklıkta depolanmış ara bellek ve bileşik alikotları kullanın. </li><li> Keskin bir makas ve cımbız kullanarak numune görülebilir bağ dokusu çıkarın; kullanabilme Bu aşama için bir mikroskop gerekirse. İyice kan ayrılması için buz-soğuğu DPBS tamponu ile numuneler- 3-4 kez yıkayın. Biyopsisinden fazla 45 dakika fazla dikkat ederek, en kısa sürede, buz gibi soğuk DPBS ile süreci örnekleri tutun. Dikkatle kas örnekten herhangi tendonları veya yağ doku kaldırmak için önlem alın. </li><li> Hemen makas steril bir çifti kullanılarak ince parçalar halinde doğrayın kas dokusu ve 1 ml TÜFE içeren pr 500 ul askıya0.2 mg / g doku konsantrasyonunda oteinase (Nagarse). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyon ile takip ve sonra buz transfer. </li><li> Otomatik bir homojenleştirici kullanılarak Nagarse ile muamele kıyılmış dokular homojenize edilir. Bu süreç boyunca buz üzerinde örnek tutun. 10.000 rpm&#39;lik bir hız ayarında otomatik homojenleştirici kullanılarak, 2 saniyelik bir darbe için, her doku numunesinde dört kez, her zaman homojen hale getirilir. Dokular arasında damıtılmış su, ardından% 70 etanol ile sonda yıkanır. </li><li> CP I (1 ml 500 ul) ve CP II 2x hacmi (2 ml 1 mi) bir eşit hacmi ile homojenleştirilir doku yıkayın ve 600 x g&#39;de, 4 ° C sıcaklıkta bulunan bir santrifüj tüpüne ve santrifüj içeriği toplamak 10 dk. Bir ıslatılmış bez ile peynir süpernatant geçmek süzüntü toplamak ve böylece olmayan mitokondriyal fraksiyonların çoğunluğunu kaldırarak, pelet atın. </li></ol> 3. Yıkama Mitokondri <ol><li> 10 ° C Yukarıdaki adımda elde edilen süpernatant santrifüj,000 xg, 10 dakika, 4 ° C. 10000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de CP II tamponu ve daha fazla santrifüj 4 ml pelet süspanse edin. NOT: Nadir durumlarda, kan ince bir pelet mitokondriyal pelet altında oluşur. Bu durumda, CPII tamponu ile yavaşça çekilerek mitokondriyal pelet çıkarın. Bu adım adım iyice 2 kanı yıkayarak önlenebilir. </li><li> CP Ben tampon 2 ml elde pelet Askıya. Bu aşamada, protein kestirimi için bu süspansiyondan küçük bir kısım kullanın. Ben yukarıdaki gibi tampon ve santrifüj CP kalan örnek süspanse. Mitokondriyal Deney Çözeltisi (MAS) ve çok az miktarda (200 ul) son pelet süspanse edin. NOT: CP I tampon BSA yok çünkü protein örnekleri daha sonra o BSA var askıya alınacak olan MAS ise, bu aşamada tahlil edilir. </li></ol> 4. tahmin bir BCA Protein Deney kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçme ile mitokondriyal İçerik <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Not: respirometrik ölçümlerde, veya Western blot deneyleri için 24 çukurlu mikro-üzerine yüklenmesi için kullanılacak mitokondri miktarını hesaplamak için bu konsantrasyon kullanın. Protein konsantrasyonu hesaplanmasında dikkate seyreltme faktörü (10) atın. Rogers, GW ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 5. XF tahlilleri yapın. 12 NOT: pmole O 2 / dk O 2 tüketimi oranını (OCR) gözünüzde canlandırın, ya da veri çıkışı O 2 ve pH mutlak seviyeleri. <ol><li> Bileşikleri hazırlamak için 1x MAS kullanarak enjekte edilecek. Aşağıdaki gibi, bir son konsantrasyon elde etmek üzere bağlantı noktaları MS bileşiklerin 10x konsantrasyon ekleyin: Noktası A ADP [Adenozin 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; B portu, oligomycin (2 uM, 55 ul); Port C, FCCP [karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon, 6 uM, 60 ul]; ve liman D, 2 mcM antimycin-A (65 ul). Hazırlamakkuyu sayısı için bileşiklerin yeterli bir miktar. </li><li> Titrasyonuyla mitokondri optimum miktarda belirleyin. Örneğin, yük 1.0 ug, 2.5 ug, ve alt tabaka ihtiva eden buzla soğutulmuş 1x MAS bir 50 ul hacim içinde oyuk başına mitokondri 5.0 ug. İlk soğuk 1x MAS + substrat 10x mitokondri sulandırmak, kuyular arasındaki değişkenliği en aza indirmek için. Sonraki, (arka plan düzeltme kuyuları hariç) her bir kuyunun bu süspansiyon 50 ul teslim. </li><li> 2000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Her bir oyuğa (bakınız aşağıda başlangıç ​​koşullarına) Santrifüj işleminden sonra, yavaşça 1 x MAS + süksinat (10 mM) ve rotenone (2 uM) 450 ul ilave edin. XF analizörü plaka transfer iyi önce homojen yapışmasını sağlamak için mikroskop altında mitokondri görüntüle. Not: solunum ya da VB kompleksi I ya da kompleks II kaynaklı olup olmadığının bağlıdır kullanılan başlangıç ​​koşullarını oluşturmuştur. Karmaşık II-odaklı solunum için, SU kullanınccinate (10 mM) ve başlangıç ​​koşulları olarak rotenon (2 uM). Rotenone blokları kompleks I ve II süksinat kompleksi (süksinat dehidrogenaz) için yakıt sağlar. Kompleks I tarafından tahrik edilen solunum çalışma yapmak için, ilk koşullar olarak 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda 5 mM veya glutamat ve malat, her bir son konsantrasyonda piruvat ve malat, her birini kullanabilirsiniz. İkincisi trikarboksilik asit döngüsü ve yüzey ulaşım arasındaki disfonksiyon ayırt yardımcı olabilir. Hem kompleks I ve II kompleksi tarafından tahrik solunum çalışma başlangıç ​​koşulları olarak rotenone veya malat olmadan piruvat ve süksinat dahil etmek. Β-oksidasyonu için bir alt-tabaka olarak palmitoil karnitin kullanın. </li><li> Sırayla önce 12 açıklandığı gibi programlayarak solunumu kullanarak gerçek zamanlı olarak mitokondriyal solunum ölçmek. Tablo 2&#39;de verilmiştir respirometredeki ayarlarını kullanın. NOT: aşağıdaki gibi çeşitli mitokondriyal solunum devletlerin kısa bir açıklama vardır: </li><li&gt; Devlet 2 = substrat mevcut ile birleştiğinde devlet; Devlet ADP doyurarak varlığında solunum fosforile 3 =; Oligomycin tarafından uyarılan Devlet 4 o = olmayan fosforile solunum; Devlet 3u = uncoupler FCCP tarafından uyarılan maksimal uncoupled solunum; Antimycin-A karmaşık III inhibisyonu sonrası rezidüel olmayan mitokondriyal solunum = solunum. Aynı zamanda mitokondriyal konsantrasyon ile birlikte OCR ölçüm uzunluğu ölçümü dönemlerinde oksijen tüketen verileri etkileyebilecek, işaret edilmelidir. </li></ol> 6. Western Blot NOT: Son örnek mitokondri zenginleştirme sağlamak için Western blot ile mitokondriyal işaretleyici COX IV ve tüm doku GAPDH belirleyin <ol><li> % 12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jelleri izole edilmiş mitokondri ve bütün doku özü ayırın. </li><li> Poliviniliden florit (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.</li><li> COX IV antikoru (1: 20,000) ile inkübe yaban turpu peroksidaz (HRP), ve ardından ikincil antikorlar ile konjüge edilmiş. GAPDH tespiti için, bir GAPDH monoklonal antikor (: 2,000 1) ile leke ve prob şerit. NOT: ER kontaminasyon farklılıklar endişe ise, böyle bir analiz ERp72, calnexin, ya kalretikulin olarak ER işaretçileri bulunur. </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

İzole edilmiş alt-tabaka, genellikle mitokondri taşıma ve TCA döngüsü fonksiyonu dahil olmak üzere VB fonksiyonunun rolü, hem de diğer mitokondri aktivitelerini incelemek çalışmalarda kullanılmıştır. Izole organelleri kullanarak Respirometrik testler oksidatif fosforilasyon temel süreçleri ve ETC içsel özelliklerinin doğrudan incelenmesine olanak Bütün hücrelerin veya permeabilize kas liflerine kıyasla izole edilmiş bir mitokondri respirometrik profili nispeten kolay veri yorumlama avantajları ve mitokondriyal kütle / biogenesizdeki olmayan mitokondriyal işlemler veya değişiklikleri &quot;girişim&quot; yokluğunu sahiptir. Verilerin Normalleştirme böylece numuneler arasında mitokondri basit çapraz karşılaştırma sağlayan, mitokondriyal protein içeriği dayanmaktadır. İzole mitokondri Respirometrik profil çalışmanın amacı altta yatan mekanizmalar ve ETC bileşeni olarak belirli hedefler belirlenmesi belirlemek için bir tercih yaklaşıms / kompleksler, ya da mitokondriyal taşıma mekanizmaları. Küçük doku örneklerinden kas biyopsisi ve fonksiyonel mitokondri izolasyonu için protokol açıklanmıştır. El dounce homojenizatörlerinin işletilen karşı bu yöntem nedeniyle otomatik homojenleştirici kullanımına kullanıcıları arasında tekrarlanabilir sonuçlar verir. Mitokondri izolasyonu kas dokusu olarak yaklaşık 20 mg ile yapılabilir. Bu örnek büyüklüğü elde edilebilir izole mitokondri miktarı daha da moleküler analiz için başka deneyler ve depolama için fazla mitokondri bırakarak Hippocampus plaka bazlı Solunum çalıştırmak için yeterli değildir. Bu yöntem, mitokondri daha küçük miktarlarda (her 1-2 ug) kullanılabilir XF 96, tercüme edilebilir belirtmek gerekir. Izole mitokondri için çeşitli protokoller ilk doku bozulması için dounce homojenizatör güveniyor. Bu yöntemin bir dezavantajı, eller, ilk doku doğası olanHomojenizasyon. homojenleştiricide tokmak ve kuvvet ve hız operatörleri 6 arasında önemli ölçüde değişebilir. Bu deney,-için-deney varyasyonu, hem de laboratuvar kadar laboratuarda değişmesine yol ve deneyler arasında veri karşılaştırması yapılmasını zorlaştırır olabilir. Katılımcılardan gelen veriler genellikle tedavi öncesi ve sonrası, ve potansiyel birden fazla site için ayrı zaman noktalarında toplanan bu insan müdahalesi çalışmalarında özellikle endişe vericidir. Biz sınırlı kişiden kişiye değişkenlik daha tekrarlanabilir sonuçlar verir daha tutarlı bir yaklaşım için bir otomatik homojenleştirici kullanın. hazırlama hızı, aynı zamanda, aynı anda birden fazla numune işleme için uygun olan, bu yaklaşım sağlar. Tipik olarak, en fazla üç deney, bir günde gerçekleştirilir. Burada tarif edilen tekniğin potansiyel sınırlamaları izole organel kullanımı ve bir plaka temelli bir biçimde kullanımı ortaya çıkar. Örneğin, Picard et al. iblis varİzole mitokondri permeabilize myofibers bozulmamış mitokondri bu temelde farklı fonksiyonel özelliklere sahip olduğu strated. Onlar mitokondriyal izolasyon teknikleri gibi daha reaktif oksijen türlerinin üretimi 13 eşliğinde permeabilize myofibers göre önemli ölçüde artmıştır RCR olarak değişmiş bioenergetic fonksiyonu, neden önerdi. Permeabilize kas lifleri ile karşılaştırıldığında, mitokondri izolasyonu uzun hazırlık süresi gerektirir. Ayrıca, hücresel içeriği kaybı fizyolojik alaka, bütün hücreler ve hatta permeabilize lifleri tutulur bir şey azalır. açıklanan teknik izni ile plaka bazlı Respirometrik kullanımı örnek başına çalışır çoğaltmak. Ancak, mitokondri de her alt uymalıdır. Bu konfigürasyon, normal ortamından farklıdır ve fonksiyonel özelliklerini etkileyebilir. Buna ek olarak, belirtilmelidir ki, mitokondriyal izolasyonu için protokol kullanılarak, TherE hala mitokondriyal hazırlık endoplazmik retikulum (ER) kirlenme olabilir. ER kirlenme farklılıklar mitokondriyal verim ve etkisi sonuçlarının belirlenmesini etkileyebilir. Sonuç olarak, bu çalışma, bu prosedür kullanılarak dokulardan izole mitokondri işlevsel olarak aktif olan ve çalışmalar / iskelet kası numunelerin minimum miktarda yüksek kaliteli izole mitokondri gerektiren uygulamalar için kullanılabileceğini teyit etmektedir verileri sunulur. Bu yöntemin avantajı şudur: i) bir iskelet kası az miktarlardaki mitokondri izole edilmesi mümkündür, ii) işlem iii) plaka bazlı teknoloji, aynı zamanda birçok örnek arasında çalıştırmak mümkündür, hızlı ve iv) örnek depolama ve diğer moleküler biyolojik araştırmalar için bioenergetic tahlil sonra yeterli artı dokusu ve izole mitokondri vardır.

Mitokondri hücrenin birincil enerji üretim alanları ve yaşlanma önemli roller yanı sıra, kalp damar hastalıkları, Alzheimer hastalığı, diyabet, kanser ve aşırı şişmanlık gibi çeşitli yaş ile ilişkili bozukluklar vardır. İzole mitokondri Respirometrik profil elektron taşıma zinciri (OGS) fonksiyonu doğrudan analiz sağlar ve mitokondriyal biyoloji anlayışımız ve sağlık ve hastalık rolüne önemli katkılarda bulunmuştur. İzole mitokondri Bu yazıda anlatılan metodoloji insan denekler elde edilen iskelet kas dokusu biyopsi izole mitokondri Respirometrik analiz izin için optimize edilmiştir vb substrat ulaşım, ATP sentaz aktivitesi, proton sızıntısı, gibi biyoenerjitiklerin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılır. Bu yazıda anlatılan biyopsi protokol son 12 yıldır bizim personel tarafından kullanılmıştır. Grubumuz, çeşitli yaş yetişkin 700&#39;den fazla prosedürleri yürüttü90 yaşına kadar, ve herhangi bir olumsuz güvenlik sorunları olmaksızın çeşitli kronik hastalık koşulları ile. Bu protokolün önemli bir yönü, özellikle böylece klinik araştırmalarda kullanımını kolaylaştıran, doku az miktarda kullanmak için tasarlanmış olmasıdır. Çeşitli protokoller mitokondri izole edilmesi için geliştirilmiştir. Fernandez-Vizarra ve ark., 1,2 çeşitli fare dokuları gibi kültürlenmiş hücrelerden mitokondri izole etmek için bir yöntem açıklamıştır. Garcia-Cazarin ve ark. 3, sıçan ve fare iskelet kaslarının mitokondri izole etmek için bir yöntem bildirmiştir. Fare beyninden alınan mitokondri izole edilmesine yönelik bir yöntem olup, aynı zamanda Iglesias-Gonzales ve ark. 4 Gross tarafından rapor edilmiştir, ve ark. 5 barocycler ve / veya PCT parçalayıcı kullanarak mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor etmiştir. Son zamanlarda, Franco ve ark. 6 anti kullanarak zenginleştirilmiş mitokondri izole edilmesi için bir yöntem rapor-TOM22 Manyetik boncukları. Bu protokoller mükemmel sonuçlar elde ederken, doku boyut gereksinimleri Bu yazıda anlatılan yönteme kıyasla yüksek. Örneğin, Gross vd. 5 gastrokinemius kası 1.5-1.8 g ve böbrek dokusu yaklaşık 2 g kullanılır. Benzer şekilde, Franco ve ark. 6 500 mg fare karaciğer dokusu kullanılır. Bizim deneyim, tipik verimleri iskelet kası (vastus lateralis) perkütan iğne biyopsisi beklenen 100-200 mg arasında değişir. Burada anlatılan protokol kullanılarak kas dokusunun 20-50 mg mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için yeteneği, diğer moleküler biyoloji deneylerinde gelecekteki kullanım için biyopsi başına ve mağaza örnekleri birden değerlendirmeler yapmalarına izin verir. Bu klinik araştırma ve örneklerin çalışkan kullanımını gerektiren diğer çalışmalarda kritik bir özelliktir. Daha önce dondurulmuş mitokondri oute bağlanmış solunum nedeniyle çalışmak için iyi olmadığını belirtmek gerekirmitokondriyal membran hasarına ve Sitokrom C aktivitesi kaybının r. Bizim yöntemi adapte Chappell ve Perry 7 tarafından yayınlanan yöntemle modifiye edilmiştir. Bu yazıda anlatılan yöntemleri kullanarak, son zamanlarda insan vastus izole mitokondri Respirometrik profil doğrudan yürüyüş hızı 8 olarak ölçülen fiziksel yeteneği ile ilişkilidir lateralis olduğunu bildirmiştir.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analyzer</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak camera assembly</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial proteinase</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito stress test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

İzole mitokondri Respirometrik profilleme yaygın elektron taşıma zinciri fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Bu, hücre dışı bir akım (XF) analiz cihazı kullanılarak, insan vastus lateralis örnekleri elde iskelet kas dokusunda en az miktarlardan mitokondri izole edilmesi için bir yöntem ve plaka bazlı respirometrik profil açıklanmaktadır. 1.0, 2.5 ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak elde edilen Respirometrik profillerin karşılaştırılması 1.0 ug solunum ölçmek için yeterli olduğunu göstermektedir ve 5.0 mikrogram standart hataların karşılaştırılması dayalı en tutarlı sonuçlar sağlar. Mitokondriyal işaretleyici COX IV olmayan mitokondriyal doku belirteci GAPDH için izole mitokondri, Western blot analizi, bu protokol kullanılarak sınırlı olmayan mitokondriyal kirlenme olduğunu gösterir. kas dokusunun az 20 mg gibi mitokondriyal Solunum çalışma yeteneği, kullanıcıların, klinik birden çalışmanın tamamlanması için bireysel biyopsi kullanmasına olanak sağlararaştırma projeleri.

Şekil 1, tüm protokol ayrıntılı akış şemasını göstermektedir. COX IV / GAPDH (Şekil 2), Western blot profilleri mitokondriyal protein COX IV olmayan mitokondriyal marker, GAPDH ekspresyonu tasvir etmektedir. COX IV ve GAPDH hem ifadesi, tüm kas hücresi içerisinde belirgindir. Mitokondri, bu protokol açıklanan tekniği kullanılarak izole sonra GAPDH aynı pozlama de yokken, COX IV bantları hala belirgindir. Uzun poz bir soluk GAPDH bandı ortaya çıkarabilir. Bu lekeler izole mitokondri az olmayan mitokondriyal kontaminasyonu sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca, izole edilmiş bir mitokondri COX IV ekspresyonu örnekler arasında tutarlıdır. Şekil 3 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug kullanılarak kompleks II (süksinat ve rotenone) tarafından tahrik tipik Respirometrik profillerini göstermektedir. Beklendiği gibi, genel olarak, OCR ağırlık arttırılıri mitokondri yüksek miktarlarda. Bu deney için hesaplanan solunum kontrol oranı (RCR) mitokondriyal hazırlık kaliteli olduğunu belirten, 7.95. Ayrıca, devlet 3u OCR mitokondriyal kalitesini onaylayan, devletin 3 biraz daha yüksektir. Mitokondri farklı miktarlarda profil oluşturma sırasında sonuç tutarlılığı karşılaştırma amacıyla, ANOVA (Varyans Analizi) oluşturulmuş ve kullanılarak varyans gerçek değerleri olarak kareler (SS) toplamı hesaplanır 1.0 ug, 2.5 ug, ve mitokondri 5.0 ug başına yüklenmiştir iyi (Şekil 4). SS devlet 2, devlet 3, devlet 3U, Antimisin ve RCR sunulmuştur. Devlet 2 ve devlet 3 ölçümler için, tek yönlü ANOVA (sırasıyla, p &lt;0.01 ve p &lt;0.05) istatistiksel olarak anlamlı idi. Benzer şekilde, tek yönlü ANOVA antimycin ve RCR (p &lt;0.01 ve p &lt;0.0001 istatistiksel olarak anlamlı idi, sırasıyla. Anlamlı fark gruplar arasında devlet 3U görüldü. These sonuçlar kuyu başına mitokondri 5,0 mikrogram diğer konsantrasyonlara göre düşük SS verdi ve katılımcıların bizim nüfusa sahip XF 24 sistemde kullanılacak optimum miktarda olduğunu göstermektedir. Şekil 5 çok mitokondriyal protein ilk kas örneklem büyüklüğü dayalı beklenebilir nasıl göstermek için bir rehber olarak hizmet vermektedir. Beklendiği gibi işlenmiş kas (mg) miktarı ve son numune toplam mitokondriyal protein içeriği (mg) arasında güçlü bir ilişki vardır. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon I (TÜFE) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry tampon II (CPII) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> 0.50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitokondriyal Deneyi Çözüm (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5mM </td></tr><tr><td> Yağ-asidi serbest BSA </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık II başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Suksinat </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Karmaşık Ben başlangıç ​​koşulları ile Mitokondriyal Testi Çözümü (MAS) </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Piruvat</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malat </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Tüm tamponlar deiyonize su içinde yapılacak </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözüm ve tampon tarifleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protokol Adımları </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Komuta </td><td> Zaman (dk) </td><td> Liman </td></tr><tr><td> Ayarlamak </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> Bir </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte etmek </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Karıştırmak </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Tedbir </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Mix, ölçmek ve respirometredeki için çevrim ayarını karıştırın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Şekil tüm protokol 1. Akış Şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. bütün iskelet kası dokusu hem de izole mitokondri için temsili bir Western blot. Tüm doku ekstraktı olarak izole mitokondri olmayan mitokondriyal kontrol mitokondriyal işareti ve GAPDH antikor gibi COX IV antikoru ile bağışık edilmiştir. Hiçbir GAPDH bandı olmayan mitokondriyal kaynaklardan az veya hiç bulaşmayı gösteren izole mitokondri gözlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> İnsan Vastus izole mitokondri Şekil 3. Temsilcisi Respirometrik profil lateralis. Izole mitokondri üç konsantrasyonları, 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug biz<html> Bu tahlilde kullanılan re. Liman enjeksiyondan sonra bileşiklerin Final konsantrasyonları 2 mM ADP (port A) idi; 2 mcM oligomycin (B portu); 6 mcM FCCP (port C); ve 2 mcM A (port D) antimycin. Bu çalışma için hesaplanan RCR 7.95 oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> 5.0 ug, 2.5 ug ve 1.0 ug mitokondri kullanarak farklı mitokondriyal solunum devletler ve RCR için kareler Şekil 4. karelerinin toplamı. Toplamı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; . Şekil 5. Bu ilk kas numune ağırlığı Regresyon analizine dayalı beklenebilir mitokondriyal protein miktarını tahmin etmek için bir rehber olarak kullanılabilir: kas (mg) ve toplam mitokondriyal protein verimi (mg) miktarı. Beklendiği gibi, kas miktarı ve elde edilen toplam mitokondriyal protein arasında doğrudan bir korelasyon vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy at JoVE.com

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K Görüntüleme.  Wake Forest School of Medicine.  Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur. 

Video: Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Gelişim Biyolojisi

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

Eksiz katı tümör homojenatlarının Mitokondriyal fonksiyonunun analitik tayini

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Kanser Araştırmaları

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Biyokimya

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biyoloji

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to investigate metabolic capability. To obtain the measures of mitochondrial respiration, fresh biological samples must be used, and the entire laboratory procedure must be completed within approximately 2 h. Furthermore, multiple pieces of specialized equipment are required to perform these laboratory assays. This creates a challenge for measuring mitochondrial respiration in the tissues of wild animals living far from physiology laboratories as live tissue cannot be preserved for very long after collection in the field. Moreover, transporting live animals over long distances induces stress, which can alter mitochondrial energetics.
This manuscript introduces the Auburn University (AU) MitoMobile, a mobile mitochondrial physiology laboratory that can be taken into the field and used on-site to measure mitochondrial metabolism in tissues collected from wild animals. The basic features of the mobile laboratory and the step-by-step methods for measuring isolated mitochondrial respiration rates are presented. Additionally, the data presented validate the success of outfitting the mobile mitochondrial physiology laboratory and making mitochondrial respiration measurements. The novelty of the mobile laboratory lies in the ability to drive to the field and perform mitochondrial measurements on the tissues of animals captured on site.

We designed and constructed a mobile laboratory to measure respiration rates in isolated mitochondria of wild animals captured at field locations. Here, we describe the design and outfitting of a mobile mitochondrial laboratory and the associated laboratory protocols.

Sahada Mitokondriyal Enerjileri Ölçmek için Mobil Mitokondriyal Fizyoloji Laboratuvarının Geliştirilmesi

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring mitochondrial function is fundamental in biomedical research. Skeletal muscle is a robust source of mitochondria, particularly in animals with a very high aerobic capacity, such as horses, making them ideal subjects for studying mitochondrial physiology. This article demonstrates the use of high-resolution respirometry with concurrent fluorometry, with freshly harvested skeletal muscle mitochondria, to quantify the capacity to oxidize substrates under different mitochondrial states and determine the relative capacities of distinct elements of mitochondrial respiration. Tetramethylrhodamine methylester is used to demonstrate the production of mitochondrial membrane potential resulting from substrate oxidation, including calculation of the relative efficiency of the mitochondria by calculating the relative membrane potential generated per unit of concurrent oxygen flux. The conversion of ADP to ATP results in a change in the concentration of magnesium in the reaction chamber, due to differing affinities of the adenylates for magnesium. Therefore, magnesium green can be used to measure the rate of ATP synthesis, allowing the further calculation of the oxidative phosphorylation efficiency (ratio of phosphorylation to oxidation [P/O]). Finally, the use of Amplex UltraRed, which produces a fluorescent product (resorufin) when combined with hydrogen peroxide, allows the quantification of reactive oxygen species production during mitochondrial respiration, as well as the relationship between ROS production and concurrent respiration. These techniques allow the robust quantification of mitochondrial physiology under a variety of different simulated conditions, thus shedding light on the contribution of this critical cellular component to both health and disease.

Horses have an exceptional aerobic exercise capacity, making equine skeletal muscle an important tissue for both the study of equine exercise physiology as well as mammalian mitochondrial physiology. This article describes techniques for the comprehensive assessment of mitochondrial function in equine skeletal muscle.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...