Bulgumuz, endotel hücreli kardiyomiyosit ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin, simüle iskemi reprofüzyon hasarına karşı kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Hücre ko-kültürü modelleri, hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık ko-kültürde kolayca mümkün değildir.
Bu çalışma, hipoksi reprofüzyon hasarını indükleyebilecek ve tek bir hücre tipi üzerindeki sonuç ve etkileri inceleyebilecek, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı hücre katmanı oluşturmayı amaçlamıştır. Her iki hücre hattını da çözerek hazırlığa başlayın. Hücreleri taze maddelerle yıkadıktan sonra T25 şişelerine yerleştirin.
Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın. Hücre kültürü inkübatörünü% 21 oksijen,% 5 karbondioksit ve% 74 azot ile 37 santigrat derecede tutun. Nemli tutun.
Kardiyomiyositlerin hücre hattı akıcılığını bir ışık mikroskobu altında tahmin edin. Ortamları birleşik hücre kültürleri içeren şişelerden çıkarın ve şişe başına üç ila beş mililitre tripsin-EDTA ile tripsinize edin. Şişeyi nazikçe çalkalayın ve iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bundan sonra, enzimatik ilerlemeyi bir ışık mikroskobu altında değerlendirin. Ayrılmadan sonra, trysin veya hücre çözeltisini T25 şişe başına 10 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe ekleyerek tripsin çözeltisini etkisiz hale getirin. Yumuşak bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca 120 x g'de santrifüj yapın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve peleti bir ortamın beş mililitresinde yeniden askıya alın. Ardından, hücre sayımı yapın ve hücre canlılığını onaylayın. 10 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre ve 10 mikrolitre tripan mavisi boyayı karıştırın ve aliquotlayın, ardından bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.
İstenilen tohumlama yoğunluklarını elde etmek için hücreleri taze normal ortamlarla seyreltin. 24 kuyucuklu bir plaka ön kaplamasını hücre dışı matris ve plaka kardiyomiyositleri ile plakanın dibine kuyucuk başına 300.000 tohumlama yoğunluklarında alın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun.
24 saat sonra, endotel hücrelerini kesici uç başına 100.000 optimum kaplama yoğunluğunda kesici uçlara plakalayın. Endotel hücre kaplamasından 24 saat sonra, kardiyomiyosit kuyucuklarının içine endotel hücre ekleri yerleştirin ve ko-kültürü başlatın. Deneyleri gerçekleştirmeden önce hücrelerin 12 ila 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin.
Hipoksik ortamı, 50 mililitrelik konik bir tüpe yaklaşık 25 mililitre ortam dökerek hazırlayın. Üstünü silikon bir membranla hava ile kapatın ve bir delik açmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Bundan sonra, başka bir delik oluşturun ve pipetlerin yaklaşık 2 / 3'ünü ortama batırılmış halde bırakın.
Ortamı dakikada 30 litre akış hızında beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın, ardından bağlı hücreler içeren 24 delikli plakaların veya kültür eklerinin ortamını atın. Bunları kuyu başına% 10 PBS'lik 100 mikrolitre ile çok nazikçe yıkayın, plakaların veya eklerin her bir oyuğuna taze hazırlanmış hipoksik ortamın 500 mikrolitresini ekleyin. Orijinal ortamı, normoksik kontrol grubunda glikoz ve serum içeren taze normal ortamla değiştirin.
Odayı nemlendirmek için hipoksi odasına steril suyla dolu bir Petri kabı yerleştirin. Daha sonra hipoksik grupları içeren plakaları odaya yerleştirin. Hipoksi odasını dakikada 30 litrelik bir akışta beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın.
Bundan sonra, odayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içine yerleştirin. Hipoksiden sonra, plakaların veya eklerin eski ortamını atın ve plakaların her duvarına glikoz ve serum içeren 500 mikrolitre normal ortam ekleyin, ardından reperfüzyonu taklit etmek için plakaları normal kültür koşulları altında iki saat boyunca bir inkübatörün içinde saklayın. Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakadan 96 delikli bir plakaya aktarın, ardından 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 200 mikrolitre ortam alın ve 96 delikli plakanın dört kuyucuğuna eşit olarak dağıtılın.
96 delikli bir plakada bir sitotoksisite testi kiti kullanarak LDH için absorbansı ölçün ve hücresel yaralanma derecesini belirlemek için üreticinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada üç tip kesici uç değerlendirilmiştir. Her üç kesici uç da 0,4 mikrometrelik aynı gözenek boyutuna sahipti.
Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin 0,5, 1,0 ve 2,0 milimetre olmasına izin veren taban yüksekliğine kadar olan uçtu. Bu protokol kullanılarak, hücreler normal oksijen koşulları altında kültürlendi ve daha sonra normoksik kontrol grubu ve hipoksi grubu olmak üzere iki gruba ayrıldı. 24 saat sonra, her iki grup da medya ile yenilendi ve son nokta tahlillerini yapmadan önce iki saat daha normal oksijen koşulları altında kültürlendi.
Tek başına kardiyomiyosit için laktat dehidrogenaz salınımını, tek başına endotel hücrelerini ve kardiyomiyositin endotel hücreleri ile ko-kültürünü değerlendirmede üç tip kültür ekinin karşılaştırılması burada normoksik, sadece hipoksi ve hipoksi reoksijenasyon koşulları altında gösterilmiştir. Hücre katmanları arasında 0.5 milimetrelik bir mesafe ile hipoksi, kardiyomiyositler tek başına kültürlendiğinde normoksiye kıyasla LDH salınımının önemli ölçüde artmasına neden oldu. Bununla birlikte, LDH, hipoksi reoksijenasyon grubunda, hipoksi sadece gruba kıyasla sadece biraz artmıştır.
Endotel hücreleri ve kardiyomiyositler birlikte kültürlendiğinde, sadece hipoksi koşulları altında LDH salınımının artması azalmadı. Bu da endotel hücrelerinin hipoksi sadece hipoksi koşulları altında tek başına kardiyomiyositler grubuna kıyasla herhangi bir koruyucu etkiye sahip olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, endotel hücreleri HR sırasında kardiyomiyositler üzerinde hafif fakat önemli bir koruma uyguladı. Hücre katmanları arasındaki mesafe bir milimetre olduğunda, LDH salınımı da kardiyomiyositlerde sadece hipoksi koşulu altında önemli ölçüde artmıştır.
Bununla birlikte, 0.5 milimetrelik ekin aksine, kardiyomiyositlerdeki LDH artışı sadece HR tarafından hipoksi koşullarına göre güçlendirilmiştir. Bu artış, iki milimetrelik kesici uç ile daha da belirgindi. İki milimetrelik eklerle kaplanmış endotel hücrelerinin konsantrasyonu, kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 hücreye titre edildi.
ko-kültürde artan endotel hücre yoğunluğunun, HR'nin neden olduğu LDH salınımının doza bağımlı zayıflamasına yol açtığı bulunmuştur. Bununla birlikte, normoksik koşullar altında böyle bir etki görülmemiştir. Bu ko-kültür metodolojisi endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerle sınırlı değildir. Bu yöntemler, ilgilenilen birden fazla organdaki çeşitli hücre hatları arasındaki spesifik hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasına yardımcı olmalıdır.
