Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL-36573 tarafından desteklenmiştir. Biz bu metni düzenlemek için Sayın David Sowa teşekkür ederim.

Fareler üzerinde tüm araştırma işlemleri ve Sağlık Ulusal Enstitüleri kurallarına göre yapıldığını ve protokolleri Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji tarafından kabul edildi. 1.. Perfüzyon Sistem Hazırlama <ol><li> Izolasyon bir gün önce, hızla alkali tortu içermeyen bir deterjan çözeltisi (rezervuar da dahil olmak üzere), tüm perfüzyon doldurun. Çözelti bir kaç saat veya gece boyunca sisteme emmek için izin verin. </li><li> Ertesi sabah, 37 ° C&#39;ye kadar PCR sıcaklığını ayarlamak ve çözelti ısınmaya bırakın. Deterjan çözeltisini çıkarın ve steril damıtılmış su ile iyice yıkayın sistemi. Tüm yan dalları unutma. </li><li> Sabit bir peristaltik pompa vasıtasıyla perfüzyon tamponu ile sistemini doldurun ve herhangi bir hava korumak için bir yan monte şırınga ile aorta odasının (kabarcık tuzak) dışarı kabarcıklar çekmekkoroner tıkanmasından kaynaklanan kalp. Peristaltik pompanın akış hızı, rutin olarak kontrol edilmelidir. </li></ol> 2.. Tamponlar hazırlanması, Kültür Medya ve Yemekleri <ol><li> Perfüzyon Tamponu: 1x perfüzyon tamponu 500 ml kullanım öncesinde emin olun. Bu, kalsiyum içermeyen tampon maddesi 113 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM KH 2 PO 4, 0.6 mM Na 2 HPO 4, 1.2 mM MgSO 4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO 3 içerir, 0.032 Kırmızı mM fenol, 30 mM taurin, 10 mM BDM ve 5.5 mM glukoz. 2 M HCI ile 7.0 &#39;a pH ayarlamak ve 4 ° C&#39; de bir 0.2 mikron filtre içinden geçirilerek filtre mağaza Not: kullanıldığında a) perfüzyon çözeltisi aynı gün hazırlanmalıdır. Bazı durumlarda, bu, 4 ° C de en az 3 gün için bir çözüm depolamak için kabul edilebilir b) Bu tampon ATP c&#39;yi azaltmak, hareketsiz kardiyomiyositlerin tutabilirsiniz 15.3 mM yüksek potasyum konsantrasyonu kadar, varonsumption ve Ca 2 +-toleranslı yeteneğini artırır. </li><li> Sindirim Tampon (300 U / ml, 25-50 ml / kalp): hemen öncesinde perfüzyon hazırlamak. Kültürü kaputu 50 ml perfüzyon tamponunda çözülür, tip II kollajenazının toplam aktivitenin 15.000 U tartılır. Nihai kalsiyum konsantrasyonu 50 uM olmak için 100 mM CaCl, 2 25 ul (steril stok solüsyonu, filtre) ilave edin. Izolasyonu için hazır 37 ° C tampon ısıtın. Tripsin farklı olarak, kolajenaz 50-100 uM Ca 2 + varlığında, en iyi şekilde çalışır. </li><li> Dur Buffer (50 ml / kalp): kültürü kaputu İşlet. , 5 ml steril FBS ile perfüzyon tampon maddesi 45 ml karıştırın. <ol><li> Ca 2 + çözeltisi (12.5 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 20 ml 100 mM CaCI2 2.5 ul ilave et ve karıştır. </li><li> Ca 2 + II çözeltisi (100 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 10 ul ilave et ve karıştır. </li><li> Ca 2 + III çözeltisi (400 uM Ca 2 +) Durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 40 ul ilave et ve karıştır. </li><li> Ca 2 + IV çözeltisi (900 uM Ca 2 +): durdurma tamponu, 10 ml 100 mM CaCI2 içinde 90 ul ilave et ve karıştır. </li></ol></li><li> Aktarım kültürü kaputu steril 50 ml konik tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM CaCl2 ihtiva eden ve FBS 5 ml MEM içinde 43 mi, BDM stok çözeltisinden 1 ml ((50 ml / kalp) orta Kaplama 500 mM, süzülerek sterilize edilmiş) ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Karıştır ve% 2 CO2, gevşek kapakları ile 37 ° C inkübatör önce miyosit izolasyon 2-3 saat boyunca dengeye getirin. Sağ miyosit kaplama önce, ortama 200 mM ATP, 0.5 ml (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) ekleyin. </li><li> Kültür ortamı (50 ml / kalp): Aktarım 48 kültür başlığı içinde steril bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM CaCl2 ihtiva eden MEM ile ml BDM stok çözeltisi (500 mM, 1 ml, filte eklemekr) sterilize edilmesi ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Mix ve% 2 CO 2, 37 ° C inkübatör önce miyositlerdeki izolasyon dengeye. Kullanımdan önce, ortama 100 mg / ml BSA, 0.5 ml (steril filtre) ekleyin. Not:% 2 CO2 inkübatör kullanarak myoctyes 24 saate kadar kendi çubuk-benzeri morfolojiye korunmasına yardımcı olur 6,9-7,0 de kültür ortamı pH, muhafaza kolaylaştırır. </li><li> Laminin (1-2 ug / cm 2) ile kaplanmış tabaklar veya plakalar: steril PBS (w / o kalsiyum ve magnezyum), 20 ml ve karıştırın Aktarma / ml doğal fare laminin 1 mg 200 ul. , 100 mm yemekleri 35 mm yemekleri, 60-mm yemekleri, 2.5 ml veya 5 ml için 1 ml ekleyin eşit yüzeylerini sallamak, yer ve CO 2% 2, 37 ° C inkübatör miyositlerdeki kaplama kadar. Not: yemekler veya kaplanmış plakalar gününde kullanılmaz, bunlar Parafilm ile kapatılır ve 4 ° C&#39;de gece boyunca (Slow Coating) saklanabilir. Sızdırmazlık requ olduğunuired buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için. Kaplanmış plakalar, 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 3.. Fare Kalp Kaldırma ve Kanülasyon <ol><li> 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde makas ve forseps ıslatın ve kurumaya bırakın. </li><li> 0.1 gram fare tartılır. Onun vücut ağırlığı, gerginlik, seks ve doğum tarihini kaydedin. </li><li> 200 ul heparin enjekte edilir (100 IU / fare) 10 dakika önce ip koroner arterlerde kan pıhtılaşmasını önlemek için anesteziye. 200 ketamin / kg vücut ağırlığı mg ve ip enjeksiyonu ile ksilazin 10 mg / kg vücut ağırlığı ile fare anestezi ve fare kuyruk / ayak tutam yanıt vermiyor 5-10 dakika kadar bekleyin. </li><li> Hafifçe perfüzyon sistemine yakın bir hayvan cerrahisi tepsi veya masa bankta bir pinnable çalışma yüzeyi (yani strafor) için forepaws ve pençelerin sabitleme tarafından yatar pozisyonda fare sabitleyin. </li><li> % 70 etanol ile göğüs ve karın silin. Ortahat cilt i yapmakBir cerrahi makas ile diyaframa orta karın ncision. </li><li> Başka bir cerrahi makas ile diyaframı kesin ve kavisli dişli forseps ile sternum tutun. Bilateral kesilmiş ve kalp maruz göğüs kafesi retroflect. </li><li> Ince kavisli tırtıklı ve atravmatik forseps kullanarak hafifçe kalp kaldırın ve dorsal göğüs duvarı mümkün olduğunca yakın göğüs boşluğundan dışarı kalbini incelemek. </li><li> Soğuk perfüzyon tampon içeren bir 100 mm tabak için kalp aktarın. Dikkatle akciğerler, timus, ve bronşlar gibi bağ dokuları uzak trim. </li><li> Genellikle timus ve yağ yastığı tarafından gizli aorta ve kranial dalları, tanımlayın. Kalp kaldırın, aort duvarı kavramak, ilk şubesini 13 aşağıda aort kesin ve hafifçe perfüzyon sıvı dolu aort kanül (düz / künt ucu ve çentikler yukarıdaki 1 ve 2 mm ile 1,0 mm OD paslanmaz çelik kanül için slip iki ultra ince uçlu f kullanarak veya 22 G yeniden beslenme iğne); ucuorceps. Not: a) perfüzyon sıvısı koroner arterleri girmesini gaz kabarcıklarını önlemek için kalp kanülasyonu sırasında damlayan olmalıdır; b) sadece aort üzerinde kanül ucu tutun. </li><li> Kanül aort Kelepçe ve 6-0 cerrahi ipek ile kanül aort Arter. Bütün kanulasyon 120 saniyeden az almalıdır. </li></ol> 4. Kalp Perfüzyon ve Sindirim <ol><li> 4 ml akış hızında, kalsiyum içermeyen perfüzyon tamponu ile kalp serpmek / dakika, yaklaşık 4-5 dakika da çıkış berrak hale gelene kadar, daha sonra 50 mM CaCl 2 ihtiva eden sindirim tamponu değiştirmek ve fare türüne bağlı olarak, 3,5-20 dakika boyunca perfüze, perfüzyon basıncı ve kolajenaz aktivitesi. Varsa sindirildiği zaman, 70-80 mmHg aorta basıncını artırır. Gerekli olduğunda, enzim &#39;in perfüze sindirim için yeniden sirküle edilebilir. Tipik haliyle, 300 U / ml enzim tamponu ml / dak, 4 &#39;lık bir akış hızında, 10-12 dakika içinde, bir kalp sindirir;70 mmHg basınç uygulayarak yükleme sonrası durumu varsa, 300 U / ml 4 ml / dk &#39;lık bir akış hızında gerekli olan sadece 3,5-5,5 dakika sürer. </li><li> Kalp biraz soluk ve sarkık olduğunda sindirim durdurmak. Nazikçe sıkışmak zaman süngerimsi olmalıdır. </li></ol> 5. Hücreler çözüşüm ve kalsiyum yeniden yerleştirilmesi <ol><li> % 70 etanol-batırılmış forseps ile kanül aort çekin ve 2.5 ml sindirim tampon içeren steril bir 60 mm çanak içine kalbini koydu. Bu steril tekniklerin dikkatli kalan ve takip adımlar, steril malzemeleri kullanarak kültürü kaputu içine taşıyın. </li><li> Ince cerrahi makas ile aort, atrial ve büyük damarları çıkarın. Yavaşça iki ucu ince forseps ile 10-12 küçük parçalar halinde ventrikül kızdırmak. </li><li> Yavaşça 10 ml transfer pipet ile kalp parçaları ve hücreleri yukarı ve aşağı ~ 10x pipet ve daha sonra bir 15-ml polipropilen konik tüp transferi. Ben 12.5 mM CaCl 2 ve transferini içeren 7.5 ml kalsiyum çözeltisi ile çanak durulayınBu tüp içine, 10 ml &#39;lik bir son hacim elde edilir. </li><li> Yavaşça yukarı ve kalp dokusunun büyük parçalarını dağıtmak için ince uçlu transfer pipet kullanarak aşağı hücre süspansiyonu pipetle. </li><li> Daha sonra, endotelyal hücreler ve fibroblastlar gibi küçük olmayan miyosit hücreleri ayırmak için 20 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Süpernatan aspire ve 10 mi kalsiyum çözeltisi içindeki miyosit pelet tekrar süspansiyon 200 mM ATP, 100 ul (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) bir takviyesi ile I. 3-5 dakika için kaputu tüp bırakın. </li><li> Transferi çubuk şekilli ve yuvarlak miyositleri saymak için bir hemasitometrede 10 ul hacimde çoğaltmak. Miyositlerin toplam sayısını hesaplayın ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak. </li><li> 20 x g&#39;de 3 dakika boyunca miyositleri santrifüjleyin. Süpernatantı ve 100 uM 2 CaCl ihtiva eden 10 ml kalsiyum çözeltisi II pelet tekrar süspansiyon. Pipetleme ucu ince bir transfer pipet miyositleri Dağılanyukarı ve aşağı. </li><li> Sırasıyla, kalsiyum III çözeltisi (400 uM CaCl2) ve IV (900 uM CaCl2) kullanılarak, yukarıdaki adım (5.8) tekrarlayın. </li><li> Fare miyosit Birincil kültür için, orta kaplama 5 ml nihai miyosit pelletini. Miyositlerin toplam sayısını ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak. </li></ol> 6.. Hücre Kültürü <ol><li> 50 ml bir tüp içinde 25.000 çubuk şeklinde bir myocytes / ml &#39;ye çubuk şekilli miyosit konsantrasyonunu ayarlayın. Yavaşça de onları askıya almak için bir 10 ml pipet kullanarak miyositleri pipetle. Her bir tabak veya levha için eşit hücre yoğunluğu sağlamak için pipet ve tüp hücre sedimantasyon kaçının. </li><li> Laminin kaplama çözümü aspire sonra, bu yemekleri veya plakalar halinde miyositleri plaka. Yavaşça kültürü kaputu yüzeyinde yemekler veya plakaları öne ve arkaya doğru ve yan-yana bir haç şeklinde bir örüntü içinde 3-4 kez kaydırın. </li><li> % 2 CO yemekleri veya tabak yerleştirin37 ° C&#39;de 2 inkübatör Yaklaşık% 80 arasında bir oranda miyosit bağlantısı oluşturmak için 1-3 saat boyunca inkübe edin. </li><li> Eki sonra, yavaşça serbest miyositleri ve hücre artıkları içeren orta aspire. Yavaşça yemekler veya levha yanlarına kültür ortamı ilave edin. Biri tarafından bu orta değişim birini yapın. Hemen inkübatör yemekleri veya plakaları dönmek. </li><li> O / N kültürden sonra, kısa süreli myocytes hücre sinyal çalışmaları daha önce BDM olmayan aynı ortam için değiştirilebilir. Hipertrofik ya da apoptoz tahliller için uzun vadeli kültür BDM tutun. Not: BDM (2,3-bütandion monoxime) miyozin-ATPaz inhibe ve kasılmasını önlemek olabilir. Miyozin-tabanlı daralmanın bunun önlenmesi kolayca tersine çevrilebilir. Bu BDM örneğin spesifik olmayan bir fosfataz olarak hareket SR kalsiyum serbest kalmasını arttırır ve serbest kalsiyum konsantrasyonu ve hücresel elektrik prope değiştirilmesi gibi bazı potansiyel yan etkilere sahip olduğu rapor edilmiştirilgili taraflar, bu nedenle tedavi öncesi, BDM çıkarılmalıdır. Ayrıca, bazı durumlarda, belirli bir miyozin II inhibitörü Blebbistatin kardiyomiyosit daralma 8,9 inhibe etmek için alternatif bir ilaç olabilir. Ancak, bizim durumlarda, BDM kardiyomiyositlerin nitelik ve nicelik uğruna Blebbistatin daha iyidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

En iyi hazırlanması için, en kritik adımlar şunlardır: 1) derhal çıkarıldıktan sonra kanül fare kalp çengel; 2) uygun kalp perfüzyon. Ayrıca, bu su kalitesini, perfüzyon sıcaklığı, tampon pH, sterilizasyon, kimyasal saflığı ve temiz, kirli olmayan boru ve odaları da önemli faktörlerdir unutmayın. M 18.2 moleküler biyoloji dereceli H 2 O yüksek tampon hazırlanması için özellikle tavsiye edilir. 200 mM ATP stok çözeltisinin pH değeri 7.2, kolaylıkla kaçırılmaz bir adıma ayarlanmalıdır. ...

Kardiyomiyositler proliferatif değildir. HL-1 ve atriyal fare tümörlerinden türetilmiş AT-1 hücreleri gibi bazı atrial kardiyomiyosit hücre çizgileri, vardır; Ancak, araştırma için hiçbir yetişkin ventriküler kardiyomyosit hücre hatları vardır. Yetişkin fare kardiyomiyositlerin birincil hücre kültürleri hücresel ve moleküler seviyede kalp araştırma için güçlü bir model sağlar. Bugüne kadar, bunlar, biyokimyasal, fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar 1 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin sık kullanılması kardiyomyosit tecrit etkili yöntemler gerektirmiştir. Saf kültür diğer organlar ile etkileşimden şartlar ve bu endojen nörohormonal ve hormon benzeri faktörler 2,3 aracılığıyla gibi sistemik dolaşım sağlar. Ancak, kardiyomiyositlerin başarılı izolasyonu zor olabilir. Biz burada tanıtmak protokol erişkin sıçan cardiomyocyt ile tecrübelere dayanmaktadıres ve O&#39;Connell ve ark 4,5 tarafından tanımlanan metot. Özellikle 2007 5&#39;de, bu hücre kültürü ve işlevsel tahlil tampon preparatlar ayrıntılı teknikleri tarif. Fare myocytes Sıçan kardiyomiyositlerinde göre kontraktürü son derece duyarlı olduğu için, fare protokolünde perfüzyon, sindirim, Ca 2 + tolerans, kaplama ve kültür için kullanılan tamponlar veya ortamı, spesifik olmayan uyanlma-kasılma bağlama inhibitörü, 2 ile takviye edilmiştir kendiliğinden kasılmasını inhibe 3-Butandion monoxime (BDM), dolayısıyla canlılığı ve çubuk şekilli miyositlerin verimi önemli ölçüde artırır. Burada tanıtılan Protokolde, miyositler tip II kolajenaz ile modifiye edilmiş Langendorff perfüzyonu ile izole edilmiş kalp yüksek potasyum tamponu içinde ayrılır. Kolajenaz II etkili hücrelerarası matrisi ve bültenleri hücreleri ayırır. Perfüzyon çözelti, aynı zamanda düşük bir seviyede 6 hücresel metabolizmayı tutar. Additi yılında, biz burada kullanılan Harvard Apparatus izole kalp sistemi, hassas sıcaklık ve sabit basınç kontrolü 7 için iyi tasarlanmış. Bu yaklaşım, yüksek oranda tekrarlanabilir hazırlıklar ve hipertrofik kalp tahlilleri için sinyal proteinleri ya da 2-3 günlük kültür ölçülmesi için bir gece boyunca kültür içinde kullanılabilecek tek bir hücre tipi, homojen popülasyonları içerir.

<table><tbody><tr><td>Isolated heart system for small rodent</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IHSR-mouse 73-4019</td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2816</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11294-00</td><td></td></tr><tr><td>Straight sharp serrated scissors</td><td>Fine science tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved, serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Straight Mini Serrefines clamps</td><td>Fine science tools</td><td>18054-28</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11575-032</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Mucosal universal detergent</td><td>Sigma</td><td>Z637181</td><td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Teknolojik gelişmeler transjenik ve gen knockout farelerde, bir çok araştırma alanlarında gerekli bir araç da dahil olmak üzere, genetik olarak modifiye edilmiş fareler yaptık. Yetişkin kardiyomiyositler yaygın iyi bir kalp hücresel fizyoloji ve patofizyolojisi için model yanı sıra ilaç müdahale olarak kabul edilir. Genetik olarak modifiye edilmiş farenin nedeniyle kardiyomiyositlerde &#39;terminal farklılaşma verimsiz olan arzu edilen genotip oluşturmak için karmaşık kardiyomiyosit enfeksiyon işlemleri için duyulan ihtiyacı ortadan kaldıracak. Yüksek miktar ve kalite fonksiyonel kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü önemli ölçüde kardiyovasküler araştırma yararlanacak ve hücre sinyal iletimi araştırma ve ilaç geliştirme için önemli bir araç sağlayacaktır. Burada, küçük eğitim ile uygulanabilecek yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için iyi kurulmuş bir yöntemi tarif eder. Fare kalp kesilmiş ve izole edilmiş kalp sistemine kanül, daha sonra, kalsiyum içermeyen ve yüksek p ile perfüzeotassium Langendorff retrograd perfüzyon modu tip II kollajenaz sindirimi ve ardından tampon. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş farelerde çeşitli fonksiyonel bir yetişkin fare kardiyomiyositlerin toplanması için tutarlı bir sonuç verir.

1.. Başarılı İzolasyon Kantitasyonu Iki kriter izolasyonu başarısını ölçmek için kullanılır: İlk olarak, toplam izole kardiyomiyositlerde sayısı, ve ikinci olarak, çubuk şeklinde kalsiyum toleranslı yuvarlak olmayan dayanıklı miyosit oranıdır. Genellikle bu protokol kalp kaldırılması miyosit kaplama ve bir yetişkin fare kalbinden verimleri yaklaşık 1 milyon çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin (hasat toplam miyositlerin% 70-90) yaklaşık 75-90 dakika sürer. Bu f...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.5K Görüntüleme.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir. 

Video: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biyoloji

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Tıp

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde İletimi

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler