TR-FRET tabanlı testler, JAK/STAT sinyal yolaklarının spesifik ve seçici modülatörlerinin taranması ve farmakolojik karakterizasyonu için yeni uygun maliyetli araçlar sunmaktadır. Bu teknik, Western blot ve ELISA gibi geleneksel yöntemlerden çok daha kolay, hızlı, tekrarlanabilir ve sağlamdır. Yıkama adımına gerek yoktur ve reaktifler tek adımda eklenir.
Bu immünoassay platformu, spesifik antikorların mevcut olması koşuluyla diğer hücre sinyal proteinlerine kolayca uygulanabilir. Tekrarlanabilir testler tasarlamak için, iyi hücre kültürü uygulamalarını kullanmalı ve standart çalışma prosedürleri oluşturmalısınız. Ek olarak, hücre kültürünü ve tedavi koşullarını dikkatlice optimize etmelisiniz.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir bilim adamı olan Genevieve Chatel olacak. Başlamak için, kültür HeLa ve A431 hücreleri, nemlendirilmiş 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöründe DMEM kullanarak% 10 FBS ile desteklenmiştir. Hücreler% 70 ila% 80 birleşime ulaştığında, onları tripsinize edin ve ya paslaşın ya da tahliller için kullanın.
Tahlili gerçekleştirmek için, önceden optimize edilmiş yoğunlukta 50 mikrolitre hücreyi, uygun kültür ortamında 96 kuyucuklu doku kültürü ile işlenmiş bir plakaya dağıtın, ardından bunları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bileşiği bir polipropilen 96 delikli plakanın 12 kuyucuğu boyunca serumsuz bir ortamda seri olarak seyrelterek test bileşiklerinin ara iki katlı ve dört katlı seyreltme serilerini hazırlayın. Hücre stimülasyonu için, simülatörü içeren 50 mikrolitre serumsuz ortamı 2X konsantrasyonda ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında veya 37 derecede önceden optimize edilmiş süre boyunca inkübe edin.
Hücre inhibisyonu için, inhibitörü içeren 25 mikrolitre serumsuz ortamı 4X konsantrasyonda ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında veya 37 derecede önceden optimize edilmiş süre boyunca inkübe edin, ardından uyarıcıyı içeren 25 mikrolitre serumsuz ortam ekleyin 4X konsantrasyonda ve önceden optimize edilmiş süre boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücreleri lize etmek için, 1X takviyeli lizis tamponunu hazırlayın ve ona fosfataz inhibitörü kokteyli ekleyin. Hücre kültürü ortamını dikkatlice çıkardıktan ve attıktan sonra, hazırlanan 1X takviyeli lizis tamponundan derhal 50 mikrolitre ekleyin ve orta derecede çalkalama ile çalkalanma altında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
TR-FRET tespiti için, 1X algılama tamponunda 4X antikor algılama karışımını hazırlayın, ardından EUAB1 ve FRAB2 antikor çözeltilerinin yanı sıra 1X algılama tamponunda EUAB3 ve FRAB4 antikor çözeltilerini hazırlayın. Son olarak, fosfoprotein tespiti için önceden seyreltilmiş EUAB1 ve toplam protein tespiti için önceden seyreltilmiş EUAB3 ve önceden seyreltilmiş FRAB4 ile önceden seyreltilmiş EUAB1'i karıştırın. Ardından, 96 delikli kültür plakasından beyaz düşük hacimli 384 delikli bir mikro plakanın bir kuyucuğuna 15 mikrolitre hücre lizatını dikkatlice pipetleyin.
Daha sonra, tahlil kuyularını ayırmak için negatif kontrol olarak 15 mikrolitre pozitif kontrol lizatı ve 15 mikrolitre 1X lizis tamponu ekleyin. 15 mikrolitre lizat içeren kuyulara, fosfoproteini veya toplam proteini tespit etmek için karşılık gelen 4X antikor tespit karışımından beş mikrolitre ekleyin. Plakayı bir plaka kapatıcı ile kapladıktan sonra, tahlil kitine bağlı olarak bir saat ila gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Kuluçka tamamlandıktan sonra, yapışkan plaka sızdırmazlık elemanını çıkarın ve plakayı TR-FRET uyumlu bir mikro plaka okuyucuda okuyun. U266B1 hücrelerinde toplam STAT1 ve fosfo-STAT4 ile fosfo-STAT1 ve A431 hücrelerinde toplam STAT5 ile fosfo-STAT5'in tespiti ve nicelleştirilmesi için TR-FRET tahlillerinin sonuçları, konsantrasyon yanıt eğrileri kullanılarak temsil edilir. Benzer şekilde, HeLa hücrelerinde fosfo-STAT3 ve total STAT3 ve fosfo-STAT6 ve total STAT6'nın tespiti ve nicelleştirilmesi için TR-FRET testleri, konsantrasyon yanıt eğrileri kullanılarak temsil edilir.
Genel olarak, tüm analizler sağlam TR-FRET sinyalleri, geniş dinamik aralıklar, düşük kuyular arası katsayı değişimi ve kabul edilebilir sinyal-arka plan oranları göstermiştir. JAK aktivatörleri, interferon alfa-2B ve IL-4 ve EGF ile hücrelerin tedavisi, spesifik tirozin kalıntılarında STAT fosforilasyonunda beklenen konsantrasyona bağlı artışı gösterirken, karşılık gelen toplam STAT proteinleri sabit kalmıştır. Hem JAK inhibitörü hem de erlotinib, karşılık gelen fosfo-STAT seviyelerini konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe etti.
Bir süspansiyon hücre hattında interferon alfa-2B ile fosfo-STAT4 stimülasyonunun veya tek plakalı protokolü kullanan bir aderans hücre hattında IL-4 tarafından fosfo-STAT6 stimülasyonunun sonuçları, iki plakalı protokol kullanılarak elde edilenlerle tutarlıydı, böylece iki plakalı bir transfer protokolünün bir plakalı hepsi bir arada kuyu protokolüne başarılı bir şekilde uyarlanabilirliğini gösterdi. Bir süspansiyon hücre hattı kullanan fosfo-STAT1 testi için plaka içi değişkenlik çalışmasının ve bir aderans hücre hattı kullanan fosfo-STAT3 testinin sonuçları, HTS uygulamaları için bu fosfo-STAT testlerinin sağlamlığını göstermektedir. Tüm hücre ekstraktında bulunan aktif fosfatazdan fosforile proteinlerin defosforilasyonunu önlemek için lizis tamponunun fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmesi esastır.
