Protokol, hassaslaştırılmış emisyonlar tarafından FRET deneylerini daha tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir hale getirmek için basit bir prosedür sağlar. FRET'in temel avantajı, dinamik süreçlerin ele alınabilmesi için gerçek zamanlı ölçümlerdir. Bir iletim fotomultiplier kullanarak lazer ayarı için, transfected protoplastları içeren sekiz kuyu kaydıranı mikroskop altına yerleştirin.
Boş bir kuyu seçtikten sonra, çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin, lazer yoğunluğunu minimuma düşür ve dedektör kazancını tespit edilebilir arka plan gürültüsüne ayarlayın. Ardından, ilgili sinyali kaydederken lazer yoğunluğunu % 0,5'lik adımlarla artırın. Yansıtıcı modu kullanarak lazer ayarı için boş bir kuyu seçin ve ardından bir yansıma filtresi uygulayın.
Yansıma modunu aç ve dedektör dalga boyu aralığının lazerin dalga boylarını kapsadığından emin olun. Çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin, lazer yoğunluğunu minimuma düşür ve dedektör kazancını algılanabilir arka plan gürültüsüne ayarlayın. Ardından, kapak kapağının yansıması görünene kadar geri hareket ettirmeden önce hedefi en düşük konuma getirin, ardından ilgili sinyali kaydederken lazer yoğunluğunu% 0,5'lik adımlarla artırın.
Veri değerlendirmesi için, verileri sinyal yoğunluklarına göre tablolayın ve sıralayın, ardından sinyal yoğunluklarını göreli lazer gücüne göre çizin ve benzer bir sinyal yoğunluğuna neden olan lazer yoğunluklarını seçin. Fotomultiplierlerin ayarlanmasında, boş bir kuyu seçin ve bir yansıma filtresi uygulayın, yansıma moduna geçin ve dedektör dalga boyu aralığının lazerin dalga boylarını kapsadığından emin olun. Çizgi tarama modunu ve histogram görünümünü seçin, dedektör kazancını maksimumun yarısına düşürün ve lazer yoğunluğunu algılanabilir arka plan gürültüsüne ayarlayın.
Ardından, kapak kapağının yansıması görünene kadar geri hareket ettirmeden önce hedefi en düşük konuma getirin, ardından dedektör kazancını 50 ila 100 volt adımda artırın ve ilgili sinyali kaydedin. Veri değerlendirmesi için, her dedektör için dedektör kazancına karşı yoğunluğu çizin, ardından benzer hassasiyet elde etmek için bireysel dedektör kazanımlarını seçin. Görüntü alımı için uygun filtreleri veya dikroik aynaları seçin ve satır satır taramayı etkinleştirmek için tüm kanallar için aynı dikroik aynayı kullanın, ardından canlı hücrelerin görüntülenmesi için bir su daldırma hedefi seçin ve orta tarama hızıyla 12 veya 16 bit taramayı seçin.
Daha sonra, gelişmiş siyan floresan protein veya ECFP ve gelişmiş sarı floresan protein veya EYFP FRET çifti durumunda, donör tespiti için tercihen 470 ila 510 nanometre ve kabul eden algılama için 530 ila 600 nanometre algılama aralığını tanımlayın. Dedektör ve lazer ayarlarını daha önce gösterildiği gibi uyguladıktan sonra, gerekirse elde edilen lazer güç tablosuna göre lazer yoğunluğunu gözden geçirin. Sinyal-gürültü oranının dedektörlerin tüm dinamik aralığını kapsadığından emin olun.
Lazer yoğunluklarını ve dedektör kazanımlarını sabit tutarken iğne deliği çapı ile ince ayar yaptıktan sonra, en az 20 hücrenin görüntülerini alarak FRET ölçümlerini gerçekleştirin. Çapraz konuşma düzeltmelerini belirlemek için, sadece donör floroforu ifade eden hücrelerle ve sadece alıcı floroforu ifade eden hücrelerle FRET ölçümleri gerçekleştirin. Ölçümlerin kalibrasyonu için donör alıcı füzyonunu ifade eden hücrelerle FRET ölçümleri gerçekleştirin.
Veri değerlendirmesi için, her profilin birden fazla hücre içermemesini sağlayan hücrelerin çizgi profillerini edinin. Profilleri metin dosyaları olarak kaydedin. Ardından, veri bölümündeki metin dosyası alma seçeneğini kullanarak metin dosyalarını bir elektronik tabloya alın.
Ardından, max işlevini uygulayarak maksimum değerleri okuyun, ardından her biri donör emisyon kimliği, FRET emisyonU, kabul eden emisyon IA ve en az dört veri kümesi, yalnızca donör, yalnızca kabul eden, bağışçı-alıcı füzyonu ve ölçümü için bir sütun içeren bir tabloda elde edilen değerleri listeleyin. Lazer ayarı, artan lazer yoğunluğu ile emisyonda doğrusal bir artış olduğunu ortaya koydu. Daha dik bir eğimde gösterildiği gibi, 514 nanometre hattının emisyonu 458 nanometre hattının emisyonunun çok daha yüksekti.
Dedektör kazanımlarının sürekli lazer gücüyle farklı şekilde farklılanarak analiz edilen her iki dedektör için de üstel bir davranış ortaya çıktı. Donörün ve kabul edenin rekombinant saflaştırılmış proteinlerle analiz edilen ve bu proteinleri ifade eden hücrelerle analiz edilen tutarsızlığı ve spektral kanaması, hücresel pigmentlerin neden olduğu canlı hücrelerde spektral kanamanın belirlenmesini atlamanın imkansız olduğunu göstermektedir. Etiketli vakuolar ATPA alt ünlemleri, VHA AECFP ve VHA AEYFP arasındaki FRET verimliliği artan sinyal yoğunluğu ile azaldı.
Buna karşılık, VHA E1 ECFP ve VHA CEYFP arasındaki etkileşim sinyal yoğunluğundan bağımsızdı. Uygun optik bileşenlerin seçimi, donörün ve alıcının tespiti için çok önemlidir. Bu protokol, bu deneylerdeki tekrarlanabilirliği artırmak için canlı hücrelerdeki oranmetrik sensörler için de uygulanabilir.
