Ligand bağlanma bölgelerinin, alt birim oryantasyonunun, ligand bağlanması ile ilişkili konformasyonel değişikliklerin ve proteinlerin dinamik hareketlerinin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin veren bir FRET haritalama metodolojisi geliştirdik. Bu tekniğin bir avantajı, çözelti içinde gerçekleştirilebilmesi ve moleküllerin serbestçe hareket edebilmesidir. Bu teknikle ölçülen mesafeler biyolojik sistemler için uygundur.
FRET birçok sistem için geniş çapta uygulanabilir. Haritalama, herhangi bir biyomoleküler sistemdeki yapısal ve dinamik değişikliklerin izlenmesini geliştirir ve özellikle üç boyutlu yapısal bilgi varsa etkilidir. Proteini saflaştırdıktan sonra, en zor kısım yüksek verimlilikle etiketlemek ve serbest boyayı çıkarmaktır.
Deneyler için, mümkün olduğunca az serbest boya elde edilmesine yardımcı olur. Başlamak için, cezalandırıcı bağlanma bölgesinin 25 ila 75 angstromu içinde ve proteinin nispeten statik bölgelerinde etiketleme bölgelerini seçin. Mesafe, kullanılacak belirli FRET boya çiftini belirleyecektir.
Etiketleme bölgelerini, birbirinden nispeten farklı olan protein bölgelerinde bulun. Böylece siteler bir üçgenin köşelerini tanımlar ve cezai bağlama bölgesi merkezde bulunur. R0 değerlerini ölçmek için, istenen küvet boyutuna ve hacmine bağlı olarak, aynı toplam protein konsantrasyonunda iki protein örneği hazırlayın.
Biri sadece donör boya ile etiketlenmiş protein ile, diğeri ise sadece alıcı boya ile etiketlenmiş protein ile. Florometreyi açın ve spektroflorometre kullanıyorsanız, FluorEssence yazılımında spektral toplama ve analiz programını açın. Bilgisayarı cihaza bağlamak için kırmızı M'ye tıklayın ve Emisyon spektrumları'nı seçin.
Toplama deneyi menü öğesini kullanarak uyarma dalga boyu, emisyon tarama aralığı, sıcaklık ve numune konumunuzu değiştirme gibi tarama parametrelerini girin. RTC'ye tıklayın ve makalede açıklandığı gibi optimize edilmiş cihaz ayarları, boyanın emme maksimumunda ayarlanmış bir uyarma dalga boyu kullanarak zirvedeki floresan emisyonunu izleyerek. Donör etiketli protein örneğini numune tutucuya yerleştirin ve numuneyi boya absorpsiyon maksimumunda heyecanlandırarak ve emisyon zirvesini tarayarak yalnızca donör boyasıyla etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını oluşturmak için çalıştır'ı tıklayın.
Taramayı zirvenin sonundan 25 ila 50 nanometre sonra uzatarak tarama için bir taban çizgisi oluşturun. Metin makalesinde açıklandığı gibi, farklı konsantrasyonlardaki numuneler üzerinde absorptsiyonlar ve floresan ölçümleri yaparak sadece donör proteininin kuantum verimini ölçün. Donör sadece protein, alıcı sadece protein ve donör-alıcı protein örneklerini aynı konsantrasyonda hazırlayın.
Floresan emisyon spektrumları oluşturmak için sadece donör taramasını edinin. Çözeltiyi donör boya emiliminde maksimumda uyarın ve donör ve alıcı emisyon zirvelerini tarayın. Numuneyi sadece alıcı proteinle değiştirin veya numuneyi değiştirin, konumunuzu sadece alıcı proteini içeren küvete değiştirin.
Yalnızca alıcı boya ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını alın. Numuneyi donör uyarma dalga boyunda uyarın. Numuneyi donör-alıcı protein numunesine değiştirin veya numuneyi donör-alıcı etiketli proteini içeren küvete değiştirin.
Aynı ayarları kullanarak donör-alıcı protein numunesinin emisyon taramasını alın. Tüm spektrumlar için, taramanın sonunda ölçülen arka plan sayılarını çıkararak arka plan floresansını düzeltin. Komutları doğrudan komut dosyasından komut penceresine uygun mesafe bilgileriyle girerek mesafeleri yapıya eşlemek için PyMOL gibi bir 3B grafik görüntüleme programı kullanın.
Ölçülen her mesafe ve ilişkili hata için bir kabuk oluşturun. Konumu farklı mermilerin kesişimi boyunca haritalayın. Sinyal peptidi bağlanma bölgesi, SecA ve SecYEG üzerindeki üç farklı konum ve sinyal peptidi üzerindeki dört farklı konum kullanılarak haritalandı.
Ön proteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasındaki FRET deneyleri, protein öncesi bağlanma bölgesini ve yönünü haritalandırır. Sinyal peptidinin cezalandırıcı bağlanma bölgesi daha önce iki sarmal parmak olarak tanımlanmıştı ve SecA C-terminal kuyruğu iki sarmal parmağa paralel bir oryantasyon önerdi. SecA37 ile PhoA2 ve PhoA22 arasındaki kararlı durum FRET spektrumları elde edildi.
Donör yoğunluğundaki azalma, PhoA22'den daha fazla enerjinin aktarıldığını göstermiştir. SecA2'den daha uzakta bulunan PhoA37 sitesine göre. Zaman çözülmüş floresan bozunma spektrumları, donör-alıcı kompleksinin, bir mesafe ile ilişkili enerji transferi ile tutarlı olarak daha kısa bir homojen bozunmaya sahip olduğunu göstermiştir.
SecA PhoA2 kalıntısı ile üçgen bölgeler arasında inşa edilen FRET mesafe kabukları, her bir kabuğun yeşil renkle gösterilen varsayılan bağlanma bölgesi olan iki sarmal parmağıyla kesiştiğini göstermiştir. Kesişen alan her FRET kabuğundan daha küçüktür ve helisel iskeleden büyük bir katkı içerir. PhoA2 kalıntısı ile etiketlenmiş bölgeler arasında belirlenen FRET mesafe kabukları, iki sarmal parmağın ucuna ve SecYEG kanalının ağzına daha yakın bulunan daha küçük bir alanı tanımlar.
Bu kesişen alan, PhoA2'den iki sarmal parmağın karşı ucunda yer almaktadır. Göz önünde bulundurulması gereken önemli şeyler, ilgi alanını üçgenleştirmek, her bir bölge için kuantum verimini ölçmek ve tüm serbest boyayı çıkarmak için etiketleme alanlarının doğru seçimini içerir. Bu yöntem, NMR veya X-ışını kristalografisi gibi yöntemlerle elde edilen yapısal bilgilerle uyumludur.
FRET sonuçları yapısal bir bağlama yerleştirildiğinde, mevcut bilgileri geliştirebilir.
