Burada, doğal hücre içi peptitleri korumak, hücre ve dokulardaki bozulmayı önlemek ve ardından izotopik etiketleme kullanarak peptitlerin göreceli nicelliğini önlemek için proteazın hızlı ısı inaktivasyonuna dayanan bir öğretim yöntemi açıklıyoruz. Bu etiketleme yönteminin çok fazla avantajı vardır. Reaktifler ticari olarak mevcuttur, ucuzdur, kimyasal olarak kararlıdır ve tek bir serumda beş numunenin analizini sağlar.
DMEM'de %15 FBS ve %1 penisilin streptomisin içeren 15 santimetrelik bir tabakta insan nöroblastom hücrelerini yetiştirerek başlayın. Hücreleri %5 karbondioksitin altında 37 santigrat derecede koruyun. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından 10 mililitre PBS ekleyin, hücreleri kazıyın ve 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Hücreleri beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin ve üst düğmeyi çıkarın. Peletin bir mililitre ultra saflaştırılmış deiyonize suyunda 80 santigrat derecede yeniden ıslatın, ardından tüpün içeriğini iki mililitrelik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Zebra balıklarının ısı inaktivasyonundan sonra, tüm beyni iki mililitrelik bir mikroyakıt tüpünde toplayın ve analize kadar eksi 80 santigrat derecede dondurun.
Doku örneğini 80 santigrat derecede ultra saflaştırılmış deiyonize suyun bir mililitresinde yeniden dirilt ve bir saniyede 30 darbe kullanarak bir probla sonicate. Hücresel lisat veya homojen dokuyu 80 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın, sonra 10 ila 30 dakika buzda soğutun. Her bir mililitre numune hacmi için bir molar hidroklorik asit stok çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin.
20 saniye boyunca girdapla karıştırın ve 15 dakika buzda kuluçkaya yatır. Hücresel lisatı veya homojen dokuyu 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatantı düşük bağlayıcı protein mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Ultrafiltrasyon cihazlarını üç dakika boyunca 2.300 kez G'de su ve santrifüj ile temizleyin, ardından suyu ultrafiltrasyon cihazından atın. Süpernatantı önceden yıkanmış 10 kilodalton kesme filtresine pipetleyin ve dört santigrat derecede soğutulmuş bir santrifüjde döndürün. Numunenin pH'ını kontrol edin.
Sütunu bir mililitre %100 asetonitrile ile dengele, sonra %0,1 trifluoroasetik asitle %5 asetonitril mililitre ile yıkayın. Numunenin tüm hacmini sütuna yükleyin ve sütunu%0,1 trifluoroasetik asitle bir mililitre %5 asetonitril ile yıkayın. Peptitleri sütundan %1.8 mililitre %1 asetonitril ile %0.15 trifluoroasetik asit ile protein düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine dökün.
Numuneyi tamamen 30 santigrat derecede vakumlu santrifüjde kurulayın ve sergilenen konsantrasyon süresini izleyin. Numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peptit örneklerini 100 ila 200 mikrolitre ultra saflaştırılmış su ve pipet 2,5 mikrolitre standart peptit konsantrasyonlarında ve numunelerde beyaz 96 kuyu plakasına yeniden saklayın.
25 mikrolitre 0.2 molar fosfat tamponu ve 12.5 mikrolitre floresan ekleyin. Yörüngesel rotatörde bir dakika boyunca nazikçe homojenize edin. Ardından, reaksiyoni durdurmak için 110 mikrolitre su ekleyin.
Spektrofluorometredeki ayarları yapın, ardından plakayı okuyun. Peptit 25 mikrograma kadar olan her peptit örneğine bir azı dişi trimetimmonyum bromürün 1/10'uncu cildini ekleyin. pH'ın beş ila sekiz arasında olduğundan emin olun, gerekirse hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ile ayarlayın.
Döterlenmemiş, döterlenmiş formaldehit veya karbon-13 döterlenmiş formaldehit dört mikrolitre ekleyin. Girdapla beş saniye karıştırın. Peptit örneğine dört mikrolitre sodyum siyanoborohidrit veya döterlenmiş sodyum siyanoborohidrit ekleyin.
Daha sonra örneği girdaplayarak beş saniye karıştırın. Peptit örneğini oda sıcaklığında iki saat boyunca duman kaputunda kuluçkaya yatırın, her 30 dakikada bir girdaplayın. Her eklemeden sonra kısırlaştırılmamış, döterlenmemiş veya karbon-13 döterlenmiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit veya döterlenmiş sodyum siyanoborohidrit, girdap eklemeyi tekrarlayın.
Duman kaputunda numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın. 16 mikrolitre amonyum bikarbonat ekleyin ve girdapla karıştırın. Örneği buza yerleştirin.
Beş saniye daha %5 formik asit ve girdaptan oluşan sekiz mikrolitre ekleyin. Peptit örneklerini birleştirin, pH'ı iki ila dört arasında ayarlayın, ardından daha önce açıklandığı gibi asetonitril ve trifluoroasetik asit kullanarak ters faz temizleme sütunlarındaki kombine numuneleri tuzdan arındırın. Numuneyi tamamen 30 santigrat derecede vakumlu santrifüjde kurulayın, ardından eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Etiketli peptitler kütle spektra kullanılarak gözlenir. Kırmızı oklar, sırasıyla iki farklı S1 ve S2 örneği arasında karşılaştırma için L1 ve L5 olmak üzere iki izotopik formla etiketlenmiş farklı peptitlerin tepe çiftlerinin varlığını gösterir. Sırasıyla L1, L3 ve L5 etiketleriyle etiketlenmiş S1, S2 ve S3 olmak üzere üç farklı örnekte bulunan bir peptitin kütle spektrumu burada gösterilmiştir.
Dört yönlü etiketleme gerçekleştirildi. S1 ve S3 kontrol örnekleri sırasıyla L1 ve L3 ile etiketlenmiş ve L2 ile etiketlenmiş S2 ve S4 olmak üzere iki deneysel örnekle karşılaştırıldığında anlamlı L4.No fark gözlenmiştir. İzotopik etiketleme, belirli bir proteaz veya peptidaz için in vitro ürünlerdeki substratları göstermek için kullanılmıştır.
Nörolisin enziminin varlığında değişmeyen bir peptit burada gösterilmiştir. Enzimin varlığında kaybolan veya azaltan peptitler substratlardır, artanlar ise ürün olarak kabul edilir. Şekil, üç farklı etiket biçimiyle etiketlenmiş bir veritabanı arama motoru tarafından gerçekleştirilen bir peptit dizisini tanımlama örneğidir.
Tanımlanmadan önce, sert asitleşmenin neden olduğu peptit bağlarının kırılmasını önlemek için numunenin tamamen serin olduğundan emin olun. Ek olarak, ultrafiltrasyon cihazlarının temizlenmesi esastır. kütle spektrometresi, peptitleri farklı deneysel koşullar arasında ölçmek ve peptidaz substratlarını tanımlayarak analiz çalışmaları için mükemmel bir yöntemdir.
