Akciğer, çok karmaşık ve benzersiz bir bağışıklık sistemine ev sahipliği yaptığı için, akciğer bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için çeşitli geçit stratejileri geliştirilmiş ve bildirilmiştir. Birkaç farklı yaklaşımın varlığı, farklı laboratuvarlar tarafından üretilen sonuçların karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır. Geçit stratejimiz, dokuz belirteç kullanarak 12 farklı pulmoner miyeloid ve miyeloid olmayan immün popülasyonu tanımlamak için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar.
Bu protokol, kararlı durum koşulları altında akciğer immün popülasyonlarının karakterizasyonunu ve tanımlanmasını açıklamaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, akciğer bağışıklık manzarasının hastalığa özgü değişikliklerini tanımlamaya yardımcı olabileceği çeşitli hastalık modellerinde bu hücre popülasyonlarının değişikliklerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu tekniği ilk kez uygulayan araştırmacılar, bağışıklık hücrelerinin akciğer dokusundan salınmasında büyük bir fark yarattıkları için sindirim koşullarına ve reaktiflere dikkat etmelidir.
Ötenazi yapılan hayvanı ameliyat için hazırlayarak başlayın. Dört ekstremitede iğneler veya bant kullanarak fareyi dorsal olarak stabilize edin, ardından ventral bölgenin cildini sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Boyundan karnına bir kesi yapın.
Cildi torasik bölgeden, kaburgalar ve sternum ile birlikte çıkarın. Tamamen beyaz olana kadar 18 ila 21 gauge iğne kullanarak sağ ventriküle 10 mililitre soğuk PBS enjekte ederek akciğerleri yıkayın. Ardından, akciğerlere dokunmadan timus ve kalbi çıkarın.
Akciğerleri çevreleyen dokulardan ayırın ve soğuk BSA tamponu içeren bir tüpe aktarın. Akciğeri bir Petri kabına aktarın, iki ince neşter kullanarak doğrayın ve ardından 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Plakayı yıkamak için beş mililitre sindirim tamponu ekleyin.
Tüpün kapağını sabitleyin ve akciğeri 37 santigrat derecede dakikada 150 dönüş hızında yörüngesel bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca sindirin. 10 mililitre soğuk BSA tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. Sindirimden sonra, akciğer parçalarını 18 gauge'lik bir iğne kullanarak karıştırın ve çözün.
50 mililitrelik yeni bir konik tüpün üzerine 70 mikrometrelik bir filtre süzgeci yerleştirin ve sindirilmiş akciğer karışımını süzgecin içine aktarın. Filtrede kalan akciğer parçalarını parçalamak ve BSA tamponu ile yıkamak için 10 mililitrelik bir şırınga pistonunun kauçuk tarafını kullanın. Tek hücreli süspansiyonu 350 G'de yedi santigrat derecede sekiz dakika boyunca santrifüj yapın.
Süpernatantı atın ve hücreleri bir mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu bir mililitrelik pipet kullanarak karıştırın ve oda sıcaklığında 90 saniye boyunca inkübe edin. Reaksiyon karışımına 10 mililitre soğuk BSA tamponu ekleyin ve dört santigrat derecede yedi dakika boyunca 350 G'de santrifüj yapın.
Süper natantı atın, peleti boyama tamponunda yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Yüzey boyama için hücreleri mililitre başına 5 milyon hücre konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Kuyu başına 200 mikrolitrede 1 milyon hücreyi 96 delikli bir plakaya aktarın ve plakayı dört santigrat derecede yedi dakika boyunca 350 G'de santrifüj edin.
Boyama tamponunda anti-1632 antikoru seyrelterek bir akış sitometri blok çözeltisi hazırlayın. Hücreleri akış sitometri blok çözeltisinin 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Süspansiyonu 15 ila 20 dakika boyunca santigrat derece veya buz üzerinde dört derecede inkübe edin.
Daha sonra, plakaya 150 mikrolitre boyama tamponu ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 G santrifüj yapın. Yüzey antikorlarını boyama tamponunda seyrelterek yüzey antikor çözeltisi hazırlayın. Hücreleri yüzey antikor çözeltisinin 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve plakayı karanlıkta dört santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, hücreleri boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Üç parça fiksasyon ve geçirgenlik seyreltici ve bir parça boyama tamponunu karıştırarak fiksasyon ve geçirgenlik tamponunu hazırlayın. Hücreleri, 96 delikli plakanın kuyucuğu başına önceden hazırlanmış tamponun 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 ila 25 dakika boyunca inkübe edin.
Bir kez geçirgenlik tamponu hazırlamak için permeabilizasyon tamponunu arıtılmış deiyonize su ile seyreltin ve hücreleri yıkamak için kullanın. Bir mililitre geçirgenlik tamponu ile seyrelterek hücre içi bir antikor çözeltisi hazırlayın. Hücreleri, 96 delikli plakanın kuyucuğu başına seyreltilmiş hücre içi antikor çözeltisinin 50 mikrolitresinde yeniden askıya alın ve karanlıkta dört santigrat derecede 40 dakika boyunca inkübe edin.
Hücreleri geçirgenlik tamponuyla, ardından boyama tamponuyla yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Akış sitometresinde numune başına en az 1,5 milyon hücre elde edin.
Başarılı bir cerrahi ve uygun postoperatif prosedürden sonra, enkaz ve çiftler bir geçit stratejisi ile dışlandı. İmmün hücreler CD45+hematopoetik belirteç kullanılarak akım sitometrisi ile tanımlandı. Hücreler canlı veya ölü olarak ayırt edildi.
İmmün akciğer hücreleri anti-GR-1 ve anti-CD68 antikorları kullanılarak üç gruba ayrıldı. Nötrofiller, benzersiz bir belirteç olarak Ly6G kullanılarak tanımlanmış ve doğrulanmıştır. CD45 + popülasyonu ayrıca doğal öldürücü hücreler, T hücreleri ve B hücreleri içerir.
Bu hücreler boyandı ve doğal katil 1.1, CD3 ve B220 antikorları tarafından doğrulandı. Bronkoalveoler lavaj, CD11b belirteci için pozitif olan eozinofilleri ve yüksek CD11b seviyelerini eksprese etmeyen alveoler makrofajları tanımladı. CD45 + dendritik hücreler bulundu ve CD24 ekspresyonu ile doğrulandı.
Bu hücreler CD103 ve CD11b belirteçlerine karşı pozitif veya negatif yanıt gösterdi. CD103 negatif hücreler, CD64 ekspresyonuna göre konvansiyonel ve monosit kaynaklı dendritik hücreler olarak sınıflandırıldı. monosit kaynaklı dendritik hücreler CD24 dendritik belirteci için düşük pozitif ve CD64 pan-makrofaj belirteci için pozitifti.
Klasik ve klasik olmayan monositli interstisyel makrofajlar CD64 ve GR-1 ekspresyonuna göre ayırt edildi. Bu hücreler CX3C kemokin reseptörü için pozitif ekspresyon gösterdi. Bu prosedürdeki en önemli adımlar, uygun doku hasadı, sindirim ve tek hücreli süspansiyonun hazırlanması ve canlı hücreler ve singletlar üzerinde geçitlemedir.
Akciğerin immün hücrelerinin akım sitometrisi ile karakterize edilmesine ek olarak, izole hücre popülasyonlarında hücre kültürü ve fonksiyonel testler yapılabilir. Bu teknik, araştırmacıların enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar ve kanser gibi akciğer hastalıklarında yeni soruları keşfetmelerinin yolunu açabilir.
