JAL, NIH hibesi K08EY030923 tarafından desteklendi; CMC, NIH Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Hastalıkları Enstitüsü'nden K01 hibesi (5K01AR060169) ve Lupus Araştırma Birliği'nden Yeni Araştırma Hibesi (637405) ile desteklendi.

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. C57BL/6 fareleri Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi'ndeki (Chicago, IL) bir bariyer tesisinde grup tarafından barındırıldı. Tüm hayvanlar, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık döngüde barındırıldı.
1. Oküler doku koleksiyonu
<ol><li>Her iki cinsiyette de 10-12 haftalık C57BL/6J fareleri, fare tepkisiz kalana ve artık solunamayana kadar karbondioksitin düzenlenmiş yönetimini kullanarak kurban edin. Ötanaziyi sağlamak için servikal çıkık veya diğer onaylanmış ikincil yöntemi gerçekleştirin. NOT: Oküler dokularda olmayan dolaşımdaki lökositleri çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yapılabilir. Bu deneyde, sistemik perfüzyon, tedavi edilmemiş veya lazerle tedavi edilmiş tüm gözlerde tespit edilen mikroglia, monositler, makrofajlar veya dendritik hücrelerin sayısını azaltmaz. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin çoğunluğu oftalmik dokularda bulunur ve bu adım isteğe bağlıdır.</li>
	<li>Gözleri enükle etmek için, prizden çıkarken gözün altına hafifçe bir çift kavisli tokmak yerleştirirken göz çukurunun yakınına bastırın. Gerçek gözü sıkmadan gözün altında kapalı olanpsları kıstırın. Gözü çevredeki konjonktivadan sökün (lütfen önceki yayına bakın)23.</li>
	<li>Optik sinir gözü ayırmak için kalan tek bağlantı olana kadar gözü yanal olarak çekin. Optik sinir genellikle gerginlikle kesilir, ancak optik siniri kesmek için bazen küçük bir makas gereklidir. Gözü 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünde kalsiyum ve magnezyum ile soğuk 1x Hank'in Tamponlanmış Tuzlu Çözeltisine (HBSS) yerleştirin.</li>
</ol>2. Oküler dokunun sindirimi
<ol><li>Soğuk HBSS'de 0.1 mg/mL sindirim enzimi ve 0.2 mg/mL DNaz içeren sindirim tamponunu hazırlayın. Başlangıçta 2 mL steril suda 5 mg sindirim enzimini yeniden inşa edin. HBSS'de 10 mg/mL DNase ilk seyreltme hazırlayın. Sindirim tamponunun her 10 mL'si için (3 hayvan için yeterli) 9,4 mL soğuk HBSS'yi 0,4 mL yeniden inşa edilmiş sindirim enzimi ve 0,2 mL seyreltilmiş DNase I ile karıştırın. NOT: Bu konsantrasyonlar, hücre ölümünü azaltırken, tek hücrelerin optimal antikor lekeleme seviyelerini sağlamak için birden fazla deneyde ampirik olarak belirlendi. Kollajenaz D, hücre canlılığı azaltılmış ve CD45+ hücreler azalmış sindirim enzimine alternatif olarak denenmiştir. Sindirimi en iyi duruma getirmek için yinelemeli işlemle ilgili daha fazla ayrıntı için lütfen Tartışma'ya bakın.</li>
	<li>10x toplam büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, soğuk HBSS'de ince tokmaklar ve yay makası kullanarak kalan konjonktivayı ve optik siniri çıkarın.</li>
	<li>Temiz gözleri kuru bir diseksiyon kabına veya küçük bir tartım teknesine taşıyın. Sindirim tamponu çıkışı için gözde görsel eksenden ve bu ilk yaradan 90° uzağa iki delikli yara yapıldıktan sonra vitreus boşluğuna 30 G iğne ile donatılmış şırınga ile 0,15-0,20 mL/göz sindirim tamponu enjekte edin.</li>
	<li>0,5 mm x 0,5 mm'den küçük tüm parçalarla yay makası ve ince askılar kullanarak tüm gözleri kıymalayın. Sonraki adımlarda pipet uçlarının tıkanmasını önlemek için lens dokusunu tokalar aracılığıyla künt mekanik bozulma ile ayrıştırmak. Her numune için, her biri 0,75 mL sindirim tamponu ile forseps ve makası küçük bir tabakta durulayın. Her örnek için yeni bir tabak kullanın.</li>
	<li>Pipet transferinde herhangi bir malzeme kaybetmemeye dikkat ederek P1000 pipet kullanarak yemeğin içeriğini buz üzerindeki bir ayrışma tüpüne aktarın. Yemeği ek 1,5 mL sindirim tamponu ile durulayın ve ayrışma tüpündeki toplam hacmi 3,25-3,50 mL'ye getirin.</li>
	<li>Dissosiyatif tüpü elektronik ayrıştırıcıya ters yerleştirin ve önceden yüklenmiş bir program olan oda sıcaklığında 200 rpm'de 1 dakika tek yönlü rotasyondan oluşan "m_brain_03_01" döngüsünü çalıştırın. Tüm dokunun sindirim tamponu ve bunun için rotor ve kalan tüm adımlarla temas halinde ayrışma tüpünün altında olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ayrışma tüpünü 37 °C'de 200 rpm'de 30 dakika boyunca sallama inkübatörüne yerleştirin.</li>
	<li>2.6 ve 2.7. İkinci 30 dk inkübasyondan sonra, adım 2.6'da olduğu gibi elektronik ayrıştırıcı kullanarak son bir mekanik sindirim gerçekleştirin.</li>
	<li>10 mL soğuk akış tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve tüpleri buza yerleştirin.</li>
</ol>3. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
<ol><li>Tek hücreli süspansiyon oluşturmak için, durdurulan göz sindirim reaksiyonunu 50 mL konik santrifüj tüpünün üstüne yerleştirilmiş 40 μm'lik bir filtreden dökün. Pistonu 2,5 mL şırıngırdan kullanarak, kalan sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden geçirin.</li>
	<li>Sindirilmemiş göz dokusu parçalarını filtreden tekrar geçirmek için aynı pistonu kullanmadan önce ayrışma tüpünü 10 mL Akış tamponu ile yıkayın ve filtreyi durulayın.</li>
	<li>5 mL Akış arabelleği kullanarak 3.2 adımını yineleyin.</li>
	<li>Ayrışma tüpünü yıkayın ve son 10 mL Akış tamponu ile filtreleyin. NOT: Toplam sindirim hacmi ve akış tamponu her numune için yaklaşık 38-40 mL'dir.</li>
	<li>Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>Steril suya 10x lysing çözeltisi ekleyerek 1x lising çözeltisi hazırlayın. Tüpü başka bir tüpe vurarak peletı parçala. Kırmızı kan hücrelerini lyse etmek için, oda sıcaklığında (RT) dönen 30 s için 1 mL 1x lising çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>20 mL Akış arabelleği ile reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>Konik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj edin. Hücre peletini bozmadan süpernatantı dekant.</li>
	<li>Tüpü başka bir tüpe vurarak peletin ayrıştırın. Tüp başına 5 mL soğuk 1x HBSS ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj tüpler. Aspirat süpernatant.</li>
</ol>4. Mononükleer fagositler için hücre süspansiyonunun lekelenerek boyanır
<ol><li>Soğuk HBSS'de Canlı/Ölü boyası 1:5.000 seyrelterek numune başına 0,5 mL Canlı/Ölü lekesi hazırlayın.</li>
	<li>Peletin tamamen ayrıştırmasını sağlamak için bir P1000 pipet kullanarak her numuneye Canlı/Ölü lekesi ekleyin. Numuneleri 1,2 mL mikro titre tüplerine aktarın.</li>
	<li>Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için küçük bir aliquot (10 μL) alın (bkz. 4.4). Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Canlı / Ölü lekeli örnekleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Örnek başına canlı hücre sayısını belirlemek için Trypan mavisini kullanarak hücreleri sayın. NOT: Tipik olarak, 10-12 haftalık bir C57BL/6J fareden 2 göz, 2 x 106'dan az canlı hücre içerir.</li>
	<li>Numuneleri 400 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL soğuk Akış tamponunda tamamen yeniden depolar. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>50 μL Fc bloğunda 5 x10 6 canlı hücreyi bloke edin (saflaştırılmış sıçan fare önleyici CD16/CD32'nin soğuk Akış tamponunda 1:50 seyreltme). 5 x 106'dan fazla canlı hücre varsa, hacimleri uygun şekilde artırın.</li>
	<li>Numuneyi tamamen dağıttığından emin olarak peletin içine Fc bloğu ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>5 x 10 6 canlı hücre başına doğrudan Fc bloğundaki hücrelere 50 μL antikor boyama çözeltisi ekleyin (çözeltiye dahil edilen her antikorun seçimi ve miktarı için Tablo1'e bakın) ve tamamen karıştırın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın. NOT: Antikor miktarları akış sitometresi konfigürasyona bağlıdır ve her laboratuvar ve cihaz için bağımsız olarak titratlanmalıdır. Filtrelerin ve aynaların cihaz yapılandırması için Tablo 2'ye bakın. Antikorları titratlamak için üreticinin önerisiyle başlayın ve boyama indeksini hesaplayın. Değişen antikor konsantrasyonlarının bir test çalışmasını gerçekleştirin (üreticinin tavsiyesinin hem üstünde hem de altında) ve boyama indeksinin tutulduğu en düşük antikor konsantrasyonu seçin. Ayrıca, tek renk kontrolünden daha az parlak pozitif boyama olduğundan emin olun. Negatif lekeli hücrelerin ölçek üzerinde olduğundan ve 1 x 102'deveya daha az bir tepeye sahip olduğundan emin olmak için lekelenmemiş hücreleri kullanın. Pozitif lekeli hücreleri tanımlamak için floresan eksi bir kontrol kullanın.</li>
	<li>Numuneleri 700 μL soğuk Akış tamponu ekleyerek yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, antikor boyamadan sonra, numuneler Akış tamponunda% 2 paraformaldehitin 500 μL'si ile sabitlenebilir. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın. Ardından, 4.10'da açıklandığı gibi bir yıkama gerçekleştirin. Sabit numuneleri 4 °C'de saklayın. Akış sitometrisi veri toplama gününde sayım boncukları eklenmelidir. Sabit numuneler 1-2 gün içinde akış sitometresinde çalıştırılmalıdır. DİkKAT: Paraformaldehit aşındırıcı ve sağlık açısından zararlıdır.</li>
	<li>Numuneleri 500 μL soğuk Akış tamponu kullanarak tekrar yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da bir mikro titer tüp rafında santrifüj tüpleri. Hücre peletini bozmadan süpernatantın yarısını aspire edin.</li>
	<li>Peletleri yeniden alıp 96 kuyuya, U-bottom test plakasına aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj plakası. Süpernatantı dekante etmek için, plakayı ters çevirin ve güçlü bir sallamada sıvıyı rahatsız edici bir pelet olmadan bir lavabo havzasına yerinden sökün.</li>
	<li>Yeni bir 1,2 mL mikro titre tüpüne, 50 μL iyi girdaplı sayım boncukları yerleştirin.</li>
	<li>Peletleri 200 μL soğuk Akış tamponunda 96 kuyu plakasında yeniden depolar. Önceki adımdan itibaren boncukların üstüne hücre karışımı ekleyin. Toplam 250 μL / mikro titre tüpü hacminde akış sitometresi üzerinde çalıştırın.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi verilerinin toplanması
<ol><li>Akış sitometresi açın ve hazırlayın. Burada listelenen talimatlar değiştirilmiş dört lazer sitometresi içindir (Tablo 2).</li>
	<li>Tüm hücrelerin her dedektör için ölçekte olduğundan emin olmak için her örnekten küçük bir aliquot içeren bir test örneği çalıştırın. Voltajları tüm hücrelerin ölçeğinde olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Boyama kokteylinde kullanılan her florofor için tek renk kontrolleri (SCC) çalıştırın(Tablo 3). Mikro titre tüpünü akış sitometresi aşamasına yerleştirmek için daha büyük bir 5 mL polistiren tüpe yerleştirin. NOT: BV421 (Pasifik Mavisi), FITC, PE, Alexa647 (APC) ve Alexa700 gibi kök floroforları kokteylle aynı antikoru gerektirmez (örneğin, CD64 PE için CD19 PE). Bununla birlikte, PE-CF594, PE-Cy7 veya APC-Cy7 gibi tandem floroforlar, konjuge floroforların potansiyel ayrışması nedeniyle SCC için kokteyl ile aynı antikoru gerektirir.<ol>
<li>1,2 mL'lik titre tüpüne 2 damla kompanzasyon boncukları ve 1 μL hamster anti-mouse CD11c BV421 ekleyerek BV421 için SCC'yi oluşturun. CD11c BV421, 5.3.3'te açıklandığı gibi kappa yerine bir IgG lambda alt tipi olduğundan kompanzasyon boncukları kullanılır. 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Amin reaktif boncuklardan bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ve ardından 1 μL Canlı / Ölü boya ekleyerek Canlı / Ölü boyası için SCC oluşturun. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Amin reaktif boncuklarından negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden bir damla pozitif boyama boncukları (yeşil kapak) ekleyerek kalan SCC'leri oluşturun, ardından 1,2 mL'lik bir titer tüpünde listelenen antikor miktarı (Tablo 3). 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yaslanın. Anti-sıçan ve anti-hamster Ig kappa boncuk setinden negatif boncuklardan (beyaz kapak) bir damla ekleyin. 0,2 mL akış arabelleği ekleyin.</li>
		<li>Girdap tüm boncuk karışımları tamamen. SCC'leri 4 °C'de 3 güne kadar saklayın. NOT: Floresan muhabir fareler için SCC, tespit edilmemiş hücrelerdir.</li>
		<li>SCC'leri çalıştırırken, SCC örneğinin aynı dedektör kanalındaki bir hücre örneği için herhangi bir floresandan daha yüksek bir tepeye sahip olacak şekilde voltajları ayarlayın. Buna ek olarak, herhangi bir SCC'nin ilgi kanalındaki histogram zirvesi ile diğer kanallar arasında en az 0,5 Log farkı olacak şekilde voltajlar ayarlanmalıdır (Şekil 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Olayları/saniyeyi 4000'in altında tutarak "Düşük" üzerinde örnekler çalıştırın. Akış hızı uygun şekilde düşürülemezse, numuneleri ek soğuk akış tamponu ile seyreltin. Sayım hesaplaması için gerekli olacağından eklenen birimi kaydedin (bkz. temsili sonuçlar).</li>
	<li>Örnek başına en az 3 x 106 olay toplayın. Bu, pigment granülleri ve sitometrenizdeki olaylar olarak sayan döküntüler nedeniyle hücre sayısından daha yüksek olabilir.</li>
	<li>Bölüm 6.4'te uygun gating stratejisi için Live/Dead dışındaki her florofor için bir Floresan Eksi Bir (FMO) kaydedin. FDO, biri hariç tüm floroforlarla boyanmış bir örnektir.</li>
	<li>Akış sitometresini üretici veya tesis talimatlarına göre temizleyin ve kapatın.</li>
</ol>6. Akış sitometrisi verilerinin ek açıklaması
<ol><li>Çözümleme yazılımını kullanarak yeni bir çalışma sayfası açın. Tüm örnekler ve tek renkli kontroller için FCS dosyalarını sitometreden içe aktarın.</li>
	<li>Ücret matrisi oluşturmak için SCC'leri kullanın.</li>
	<li>Kompanzasyon matrisini lekeli örneklerinize ve IPO'larınıza uygulayın.</li>
	<li>Kapıları çizmek için pozitif boyamayı belirlemek için IPO'ları kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+physiology+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li>
<li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li>
<li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li>
<li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099(2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935(2013).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li>
<li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313(2014).</li>
<li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636(2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+microglia%2C+and+not+peripheral+macrophages%2C+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li>
<li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li>
<li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li>
<li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+CD11b+%2BMonocytes+and+Anti%E2%80%93Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22AJOPHT%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li>
<li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li>
<li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).</li>
<li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li>
<li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Çok parametreli akış sitometrisi, karmaşık bir dokudaki birden fazla hücre tipinin nicel analizini sağlar. Bu raporda, fare gözünde lazer yaralanmasından sonra monositler, dendritik hücreler ve makrofaj alt kümeleri de dahil olmak üzere mononükleer fagosit popülasyonlarının akış sitometrik tespitini açıklıyoruz. Liyanage ve arkadaşları son zamanlarda nötrofilleri, eozinofilleri, lenfositleri, DC'leri, makrofajları, sızan makrofajları ve monositleri tespit etmek için benzer bir gating stratejisi bildirdi27. Gating stratejimiz öncelikle CD64'ün eklenmesiyle farklılık gösterir. Liyanage ve diğerleri DC'yi CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c+ hücreler ve makrofajları CD4 - CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- hücreler olarak tanımlar. DC'yi CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b+CD11c+CD64- hücreler ve makrofajları CD4-CD8-B220-Ly6G-SiglecF-NK1.1-CD11b + CD64+hücreler olarak tanımlıyoruz. CD64'ün DC'yi makrofajlardan ayırt etmek için kullanımı iyi belirlenmiştir6ve bu strateji, CD11c+ makrofajlar da dahil olmak üzere makrofaj heterojenliğini tanımlamamızı sağlar. Bu yöntemin en büyük sınırlaması, doku mimarisi veya göz içindeki belirli hücrelerin konumu hakkında veri sağlamamasıdır. Bu hücrelerin retina, koroid, iris veya başka bir oküler yapıda olup olmadığını belirlemek için, protokolümüz histolojik yöntemlerle birleştirilebilir veya her oküler alt komplemde ayrı ayrı çok parametreli akış sitometrisi çalıştırmak için daha kapsamlı oftalmik diseksiyon içerecek şekilde değiştirilebilir.
Diseksiyonun yarattığı herhangi bir varyansı önlemek için tüm fare gözlerinin sindirimi için protokolü optimize ettik. Örneğin, kornea, iris ve lensin çıkarılmasıyla arka göz kapaklarının diseksiyonu, tutulan iris veya kornea malzemesinden (eksik diseksiyon) değişkenlik veya normal arka göz kabı bölgesine (aşırı diseksiyon) artan lazer yaralanması yaratabilir. Kontrol unlasered ve lazerli gözler arasındaki karşılaştırmamız, retinochoridal yaralanma nedeniyle mononükleer fagositlerin sızmasını algılar. Sistemik hastalıkların göz üzerindeki etkilerinin yani üveit ve diyabetin analizi için bireysel oküler alt ünite analizi şarttır. Protokolün bölüm 2'sinde sindirim yöntemi en kritik olanıdır, bölüm 3 - 5'teki diğer adımlar birden fazla doku tipinde başarıyla kullanılmıştır24. Sindirim koşullarımıza, içeren yinelemeli bir yöntemle ulaştık: (1) kimyasal sindirim yönteminin (Kollajenaz D vs sindirim enzimi), (2) kimyasal sindirim uzunluğunun belirlenmesi (30, 60 ve 90 dakika) ve (3) mekanik sindirim ilavesi (hiçbiri, bir kez, iki kez, üç kez). Her adımda sindirim koşullarının başarısını hücre canlılığı ve CD45HiCD64+ (makrofajlara sızan) hücrelerin sayısına göre değerlendirdik. Sindirim enziminin (bkz. Ek Malzeme Tablosu) Kollajenaz D'den daha fazla canlı hücre kurtardığını ve sindirim enzim konsantrasyonunun yarısının denenmesi makrofajların daha az sızmasına neden olduğunu bulduk. Daha sonra, mekanik sindirim ile 60 dakikalık kimyasal sindirim, sızan makrofaj popülasyonlarını neredeyse ikiye katladı. Üç mekanik sindirim, %25-30 canlı singlet hücreleri ve en çok sızan makrofaj popülasyonları ile optimaldi. Son olarak, daha hızlı mekanik sindirim koşulları hem canlı hücrelerin hem de makrofajların ciddi kaybına neden oldu.
Gelecekte, kornea, iris ve lensi çıkararak ve ardından retinayı ve arka göz kabını (sklera, koroid ve retina pigmentli epitel) ayrı ayrı sindirerek yöntemi genişletmeyi öneriyoruz. Bu modifikasyon ile sırasıyla lens ve korneanın proteinasöz ve yoğun özellikleri nedeniyle sindirim koşullarını azaltmayı bekliyoruz. Bu azalmalar arasında sindirim enzim konsantrasyonunun azalması, Kollajenaz'a geçilmesi, sindirim süresinin azalması veya mekanik sindirim miktarının azalması sayılabilir. Arka göz kabı için genel olarak daha az sindirim koşulları ve sadece retina için daha da azalmış sindirim koşulları bekliyoruz.
Gelecekteki ek talimatlar arasında geleneksel çok parametreli akış sitometri panelimizin geleneksel 6 lazer aletine veya spektral akış sitometrisine genişletilmesi yer almaktadır. Spektral akış sitometrisi, mevcut filtreler tarafından belirlenme yerine tüm spektrumda florofor tespitini sağlar. Spektral akış sitometrisi daha spesifik renk algılama ile sonuçlanır. Bununla birlikte, spektral akış sitometrisi, takip edilmesi gereken tamamen yeni bir dizi husus gerektirir ve bu makalenin kapsamı dışındadır. Daha fazla bilgi için, lütfen bu son JoVE makale28' e bakın. 6 lazer aleti, 6-9 dedektör ekleyen ultraviyole lazer içerir. Fare göz akışı sitometri paneline işaretleyiciler eklerken, daha fazla oküler hücre tipinin algılanmasını öneririz. Örneğin, Soyu kapısı nötrofilleri, eozinofilleri, mast hücrelerini, NK hücrelerini ve lenfositleri bağımsız olarak tespit etmek için ayrılabilir. Sabit durumdaki makrofajların az sayıda olması nedeniyle mononükleer fagositlerin alt küme algılamasının artırılması önerilmez. Yeni antikorlar eklerken, dikkatli antikor titrasyonu öneriyoruz.
Özetle, fare gözünde mononükleer fagosit popülasyonlarının tespiti için uyarlanabilir, sağlam bir yöntem sunduk. Monositlerin, dendritik hücrelerin, makrofajların ve mikrogliaların yüksek oranda örtüşen hücre yüzeyi belirteçleri nedeniyle, çok parametreli akış sitometrisi bu hücresel popülasyonları tespit etmek için en iyi yöntemdir. Akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik değerlendirme için hücre tiplerinin analizi, kader haritalaması ve/veya hücre sıralama için kullanılabilir. Başlıca sınırlaması doku mimarisi eksikliğidir ve temel bulgular geleneksel histoloji kullanılarak doğrulanabilir.

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kompleman aktivasyonunu ve iltihabı uyaran birden fazla hücre tipi içerir. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasında doğal öldürücü (NK) hücreler, mast hücreleri, bazofiller, eozinofiller, nötrofiller ve mononükleer fagositler bulunur. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerden oluşan mononükleer fagositler, üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) dahil olmak üzere birden fazla oftalmik durum patofizyolojisinde yer1. Bu protokolde, neovasküler AMD2'ninbir fare modelinde çok parametreli akış sitometrik analizi kullanarak mononükleer fagositlerin tanımlanmasına odaklanacağız. Bu protokol diyabetik retinopati ve/veya üveit fare modelleri için uyarlanabilir, ancak bu hastalıkların sistemik doğası nedeniyle daha kapsamlı oküler diseksiyon önerilir.
Mononükleer fagositler çakışan hücre yüzeyi işaretleyicilerini ifade eder. Uzun ömürlü doku yerleşik makrofajlar ve mikroglia yumurta sarısı kese türevi eritromileoid progenitor3'ten kaynaklanırken, makrofajların ve dendritik hücrelerin geri dönüşümü kemik iliği türevi makrofaj dendritik hücre progenitor4'tenfarklıdır. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerde ortak olan fare hücresi yüzey işaretçileri CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17ve hücre içi işaretleyici Iba18 'iiçerir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, birden fazla dokudan gelen makrofajların, monositlerin ve dendritik hücrelerin transkriptomik analizi CD64'ü makrofaja özgü bir hücre yüzeyi işaretleyicisi olarak tanımlar6. Makrofajlar sağlıklı gözlerde iris, koroid, silier vücut ve optik sinirde tanımlanmıştır3. Alternatif olarak, dendritik hücre tanımlaması daha zordur; dendritik hücre tanımlamanın en özel yöntemi, Zbtb46-GFP muhabirfaresi 9kullanılarak kader eşlemesi gerektirir. Bu muhabir satırından bağımsız olarak, CD64 yokluğu ile birlikte CD11c ve MHCII ifadesi potansiyel dendritik hücreleritanımlayabilir 6,10. Normal gözlerde kornea, konjonktiva, iris ve koroidde dendritik hücreler tanımlanmıştır11. Mikroglia retinada bulunan, kan-retina bariyeri ile korunan ve yumurta sarısı kesesi progenitör hücrelerinden elde edilen özel makrofajlardır12. Sonuç olarak, retinal mikroglia monosit türevi makrofajlardan CD45 ekspresyon13 loş seviyeleri ve akış sitomemetri antikoru 14 olarak kullanılabilen yüksek Tmem119 seviyeleri ile ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mikroglia aktivasyonu üzerine, CD45 yukarı regüle edilebilir15 ve Tmem119 aşağı düzenlenmiş olabilir3Mikroglia biyolojisinin karmaşıklığını gösteren ve bu muhtemelen hem AMD hem de fare modelinde geçerlidir. Son olarak, monositler klasik ve klasik olmayan dahil olmak üzere en az iki alt tipe ayrılabilir. Klasik monositler CCR2+Ly6CyüksekCX3CR1düşük ifadesini gösterir ve klasik olmayan monositler CCR2-Ly6CdüşükCX3CR1yüksek işaretleyicilerigösterir 5.
İşaretçi ekspresyonunun nicel analizinin gerekliliği nedeniyle, yani yüksek ve düşük/loş seviyeler, çok parametreli akış sitometrisi, göz ve diğer dokulardaki monositler, makrofajlar, mikroglia ve dendritik hücreler arasında ayrımcılık için ideal bir yöntemdir. Ek avantajlar arasında alt popülasyonların tanımlanması, hücre popülasyonlarını transkriptomik veya proteomik analiz için sıralamak için floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanma yeteneği ve kader haritalaması saydır. Çok parametreli akış sitometrisinin en büyük dezavantajı doku mimarisinin olmamasıdır. Bu, oftalmik diseksiyonun çeşitli oküler alt bölümlere girmesiyle aşılabilir: kornea, konjonktiva, iris, lens, retina ve koroid-sklera kompleksi. Ek olarak, doğrulayıcı immünofluoresans görüntüleme yapılabilir, ancak belirteç sayısı ve sağlam miktar eksikliği ile sınırlıdır.
Genom geniş ilişki çalışmaları AMD16ile birden fazla tamamlayıcı gen bağlamaktadır. Kompleman aktivasyonu anafilatoksin üretimine, lökosit alımına ve ortaya çıkan iltihaplanmaya yol açar. Kompleman reseptör eksikliği olan farelerde lazer yaralanması mononükleer fagosit alımını ve lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) alanını azaltır17. Benzer şekilde, dokuya monosit alımında eksik olan C-C motifli kemokin reseptörü 2 (CCR2) nakavt faresi, hem mononükleer fagosit alımının azaldığını hem de lazer kaynaklı CNV alanı18. Bu veri bağlantısı, deneysel CNV ve muhtemelen neovasküler AMD ile mononükleer fagositleri tamamlar ve tamamlar. Bu ilişkiyi desteklemek için, kompleman reseptörleri neovasküler AMD19,20olan hastalarda periferik kan monositleri üzerinde disregüle edilir. Bu veriler AMD ve mononükleer fagositler arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir.
Bu yazıda, çok parametreli akış sitometrisi kullanarak fare gözündeki mononükleer fagosit popülasyonlarını karakterize etmek için deneysel lazer kaynaklı CNV modelini kullanacağız. Lazer kaynaklı CNV, mevcut ilk hat neovasküler AMD tedavisinin etkinliğini gösteren neovasküler AMD'nin standart fare modelidir21. Bu protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek hücreli süspansiyona sindirimi, antikor boyama, tek renk kontrolleri kullanılarak lazer voltajlarının belirlenmesi ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak gating stratejisini tanımlayacaktır. Lazer kaynaklı CNV modelinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen önceki bir yayına bakın22. Bu protokolü kullanarak mikroglia, monositler, dendritik hücreler ve makrofaj popülasyonlarını tanımlayacağız. Ayrıca, lazer kaynaklı CNV modeli içinde makrofaj alt kümelerini daha fazla tanımlamak için MHCII ve CD11c'yi kullanacağız.

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Doğuştan gelen bağışıklık sistemi üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu dahil olmak üzere oküler patofizyolojide önemli roller oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle mononükleer fagositler, üst üste binen hücre yüzey belirteçlerini ifade eder, bu da bu popülasyonları tanımlamayı zorlaştırır. Çok parametreli akış sitometrisi, fare gözlerindeki monositleri, makrofajları, mikrogliaları ve dendritik hücreleri ayırt etmek için birden fazla hücre yüzey belirtecinin eşzamanlı, nicel analizine izin verir. Bu protokol, tüm fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek bir hücre süspansiyonuna sindirimi ve miyeloid hücre belirteçleri için tek hücre süspansiyonunun lekelenmesini açıklar. Ek olarak, tek renk kontrolleri kullanarak voltajları belirlemek ve floresan eksi bir kontrol kullanarak pozitif kapıların sınırlandırması için uygun yöntemleri açıklıyoruz. Çok parametreli akış sitometrisinin en önemli sınırlaması doku mimarisinin olmamasıdır. Bu sınırlama, bireysel oküler bölmelerin çok parametreli akış sitometrisi veya ücretsiz immünoresans lekeleme ile aşılabilir. Bununla birlikte, immünofluoresans, nicel analiz eksikliği ve çoğu mikroskopta florofor sayısının azalması ile sınırlıdır. Lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyonda mononükleer fagositlerin yüksek nicel analizini sağlamak için multi-parametrik akış sitometrisinin kullanımını açıklıyoruz. Ayrıca, çok parametreli akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik çalışmalar için makrofaj alt kümelerinin tanımlanması, kader haritalaması ve hücre sıralama için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.9K Görüntüleme.  Northwestern University. Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Video: Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Tıp

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Nörobilim

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Doku temizleme ve floresan etiketleme kullanarak retinal perisitlerin görselleştirilmesi

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biyokimya

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama

Bir yutulma Deneyi: CNS Fagositler ve nöronlar arasındaki etkileşimi değerlendirmek için bir protokol

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Fagositoz fare makrofajlar tarafından hızlandırılmış 3D görüntüleme