Küçük miktarlarda nöral dokunun başarılı bir şekilde ayrıştırılması, laboratuarları tedavi etkinliği, hücresel fonksiyon, hastalık ve tedavi etki mekanizmaları hakkında yapıya özgü bir anlayış kazanmak için donatabilir. Bu nöral ayrışma protokolü sürekli olarak oldukça uygulanabilir ve gerçek bir tek hücreli süspansiyon sağlar. Ek olarak, ticari kitlerin amaçlandığının sadece bir kısmı olan numuneleri işleyebiliriz.
Doğru planlama ve hazırlık, bu teknik için başarılı bir sonucun anahtarıdır. Protokolü tanımak için birkaç alıştırma turu yapmak faydalı olacaktır. Altı aylık bir dişi C57BL / 6J fareyi uyuşturduktan sonra, alt karnı sıkıştırın ve forseps kullanarak cildi kaldırın.
Daha sonra makas kullanarak, kürk ve cildi göğüs kafesinin dibine kadar kesin. Göğüs kafesinin altından başlayarak her omuza doğru hareket eden iki çapraz kesi yapın. Daha sonra kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve göğüs kafesini dikkatlice rezeke edin.
Kalbin etrafındaki herhangi bir bağ dokusunu dikkatlice çıkardıktan sonra, sağ atriyumu kırpmak için makas kullanın. Ardından solunum cihazına izofluran akışını kapatın. Kalbi forseps ve kelebek iğnesinin eğimi yukarı bakacak şekilde sabit tutarak, iğne seviyesini ve hayvana paralel tutarken sol ventrikülü delin.
Daha sonra, iğneyi yerinde tutarak, pompayı açın ve kalpten çıkan sıvı opak olana ve karaciğer ve akciğerler soluk olana kadar en az 30 mililitre salin veya heparin çözeltisini perfüze edin. Perfüzyondan sonra, pompayı kapatın, iğneyi çıkarın ve fareyi diseksiyon alanına aktarın. Kafa kesmeden sonra, kürkü başın arkasından gözlere kadar kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi tekrar soyun.
Ardından, kafatasını gözlerin arasına yerleştirin ve kafatasının arkasında saat 10 ve 2 pozisyonlarında iki kesik yapın. Ardından, kafatasının midsagital çizgisi boyunca gözler arasındaki orijinal kesime uzun bir kesim yapın. Daha sonra, forseps kullanarak, kafatasının iki yarısını yanlara doğru soyun.
Daha sonra beyni çıkarmak için bir spatula kullanın ve soğuk DPBS ile doldurulmuş ve buz üzerinde tutulan 60 milimetrelik bir cam Petri kabına yerleştirin. Bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, her yarım küreyi ayırın ve koku alma ampullerini ve beyinciği çıkarın. Daha sonra hipokampus açığa çıkana kadar orta beyni çıkarın.
Daha sonra, beyni forseps ile güvence altına alın. Daha sonra ikinci bir forseps seti kullanarak, hipokampüsü her yarım küreden nazikçe kızdırın. Her iki hipokampiyi de soğuk DPBS içeren etiketli 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
Forseps kullanarak, hipokampi doku parçalarını bir C tüpüne aktarın ve tüpe 30 mikrolitre enzim karışımı 2 ekleyin. Kapağı büktükten ve tıklayana kadar sıktıktan sonra, tüpü bir ayrıştırıcıya yerleştirin ve uygun programı çalıştırın. Program çalışırken, iki mililitre BSA tamponu ile 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecini önceden ıslatın.
Ayrışma programı tamamlandıktan sonra, ayrışmış dokuya dört mililitre BSA tamponu ekleyin ve karışımı 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün. Ardından, C tüpüne 10 mililitre DPBS ekleyin. Ardından tüpü kapatın, çözeltiyi yavaşça döndürün ve 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün.
Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu santrifüj edin, pelet rahatsız etmeden süpernatantı atın ve peleti saklayın. Enkaz kaldırma için, peleti 1.550 mikrolitre soğuk DPBS ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından 450 mikrolitre soğuk döküntü giderme çözeltisi ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin.
Hücre süspansiyonunu yavaşça bir mililitre soğuk DPBS ile kaplayın ve ucu konik tüpün duvarına karşı tutun. Toplam kaplama iki mililitre olana kadar prosedürü tekrarlayın. Daha sonra, süspansiyonu tam hızlanma ve tam mola ile 10 dakika boyunca 3.000 kez G'de santrifüj yapın.
En üst tabakayı aspire edin, ardından beyaz orta tabakayı aspire etmek için pipet ucunu ileri geri süpürün. En alt katmanı rahatsız etmeden orta katmanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Ardından, karıştırmak için iki mililitre soğuk DPBS ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin.
Daha sonra süspansiyonu tam hızlanma ve tam mola ile 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre BSA tamponunda yeniden askıya alın. Hücre sayımından sonra, kalan hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peleti 50 mikrolitre seyreltilmiş canlı ölü lekede yeniden askıya alın.
Daha sonra numuneyi etiketli bir akış tüpüne aktarın ve karanlıkta 8 ila 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 500 mikrolitre BSA tamponu ekleyin ve santrifüjleme adımını tekrarlayın. Daha sonra süpernatanı atın ve tüpte az miktarda tampon bırakın.
Birincil kapı, ileri saçılmaya karşı yan saçılma grafiklerindeki kalıntıları dışladı ve ölü hücreler daha sonra dışlandı. İkinci kapı, miyelin bazik proteini için pozitif hücreleri dışladı. Ve kalan hücrelerden, her florokrom için pozitif hücrelerin yoğunluk grafikleri oluşturuldu.
Her nöronal hücre popülasyonunun sıklığı üçüncü kapıdan hesaplandı. Manuel mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim ile işlenen örnekler, ilgilenilen hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir popülasyonunu verirken, otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim ile işlenen hem taze hem de sabit örnekler, ilgilenilen hücrelerin birkaç kat daha yüksek bir popülasyonunu göstermiştir. Perfüzyon ve enkaz kaldırma adımları başlangıçta zor olsa da, pürüzsüz ve sabit bir elin korunması başarının sağlanmasına yardımcı olabilir.
