Bu eser MRC, AB FP7, ARUK, Wellcome Trust ve Parkinson İngiltere tarafından desteklenmiştir. Biz de onun katkı confocal görüntülerin ve el yazması ve metodoloji yapıcı kendi giriş için laboratuara üyeleri için Bayan Johanna Buchler teşekkür etmek istiyorum.

tüm fare ve sıçanlar kullanarak deneyler kabul edildi ve programı 1 yordamları kullanarak yapılan kapalı ev ofis hayvanlar (bilimsel yordamlar) Yasası 1986. Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tarifi-ebilmek bulunmak Tablo 1 ' de.
 1. akut Hipokampal dilim hazırlık <ol><li>fare beyin bir spatula kullanarak, mümkün olduğunca hızlı bir şekilde kaldırmak ve keskin makas kafatası kesip içinde buz gibi yer, (% 95'i O 2, % 5 CO 2), oksijenli yüksek-Sükroz ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Fare beyin üzerinde Petri kabına yerleştirin ve beyincik ve frontal korteks beynin orta hat aşağı hemisecting önce bir neşter ile küçük bir bölümünü kaldırmak.</li>
	<li>İki hemisferlerin sadece kesildi yanına koyun ve bir vibratome sahneye her hemisphere tutkallayın.</li>
	<li>200-300 µm kalınlığında kesitler ilgi tam bölgesinin kesti. Hippocampus söz konusu olduğunda, yaklaşık 3-4 dilim başına Yarımküre alınmalıdır.</li>
	<li>Plastik Pasteur pipet kullanarak oksijenli (% 95'i O 2 ' de, % 5 CO 2) batık bir odasına dilimleri transfer ACSF. 30 dk. 34 ° C'de korumak 
	Not: Dilimleri tedavi rekombinant Dkk1 proteinler gibi etkin farmakolojik ajanlar ile bu aşamada dilim odasına aracıları ekleyerek gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Dilimleri bir fırça kullanarak odasından kaldırın, onları 24-şey plaka yerleştirin ve düzeltmek için % 4 paraformaldehyde içinde 1 h 20 min (PFA)/4% Sükroz, oda sıcaklığında (RT). 
	Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>Yıkama dilimleri üç kez 1 X PBS (10 dk her). 
	Not: dilimleri 1 X PBS 4 ° C'de tutulur sürece protokol burada 1-2 gün boyunca, duraklatılmış.</li>
</ol> 2. Sinaptik işaretçileri için ayirt Not: kullanılan tüm arabellekleri tarifleri Tablo 2 ' de bulunabilir.
<ol><li>Dilim wells PBS engelleme/permeabilizing arabellek (Tablo 2) ile değiştirin ve RT için 4-6 h., kuluçkaya</li>
	<li>VGlut1 adlı bir 1:2,000 seyreltme engelleme/permeabilization tampon karşı poliklonal eskiden şiling şimdi domuz antikor sulandırmak. 
	Not: vGlut1 önceden sinaptik uyarıcı terminal görüntüleme için bir belirtecidir. Post sinaptik uyarıcı synapse kimlik için PSD-95 ve seyreltik 1:500 karşı poliklonal antikor aynı çözüm içinde kullanın. 300 µL en küçük bir birim her kuyuya kullanın. Hipokampüs anatomik konumunu belirlemek için de MAP2 veya tübülin gibi nöronal yapıyı tanımlayabilir bir antikor kullanın. İş dışarı doğru seçim (öncesi ve sonrası sinaptik) sinaptik işaretçileri için tüm birincil antikorlar konsantrasyonları ve taze engelleme/permeabilizing tampon seyreltik.</li>
	<li>Birincil antikor çözüm dilimleri gecede (veya 1-2 gün) 4'te kuluçkaya ° C. kullanım titreyen bir platform ile beraber güçlü hareket.</li>
	<li>Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.</li>
	<li>Uygun ikincil antikorlar 1:500 engelleme arabelleği sulandırmak. Örneğin, vGlut1 eskiden şiling şimdi domuz antikor kullanırken, belirli bir fluorophore Birleşik eskiden şiling şimdi domuz bileşeni (Örneğin, eşek anti-guinea-pig) tanır ikincil bir antikor geçerlidir. PSD-95 tavşan antikor kullanırken, farklı bir özel fluorophore için Birleşik tavşan bileşeni (Örneğin, eşek Anti-tavşan) tanır ikincil bir antikor geçerlidir.</li>
	<li>İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi 2-3 h RT. dilimleri gelen ışık, korunmasını sağlamak için bu çözüm dilimleri kuluçkaya.</li>
	<li>Dilimleri üç kez PBS (10 dk her) yıkayın.</li>
	<li>Dikkatle dilimleri bir fırça kullanarak 24-şey plaka kaldırmak ve eşit olarak önceden etiketli cam slaytlar koyun. Montaj orta her dilimin üzerine bir damla ekleyin ve sonra yavaşça dilimlerin üstünde bir cam coverslip yerleştirin. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Yeterli montaj orta (300-400 µL), kullanmak için yeterli bir miktar dilim kurumaya yol açabilir gibi dikkat.</li>
	<li>İçin en az 1-2 gün RT, Kuru ve ışıktan korunan slaytlar tutmak için bırakın.</li>
	<li>Kısa vadeli, ancak uzun süreli depolama için slaytları 4 ° C, depolama, -20 et ° C.</li>
</ol> 3. Confocal resim alma ve analiz <ol><li>confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak Imaging.
	<ol><li>Yansıması Hipokampus bölgesi tanımlamak (Örneğin, 1 ve 3 (CA1, CA3) cornu ammonis veya dentat gyrus (DG)) 10 x veya 20 x hedefi.</li>
		<li>Değişim 40 x veya 63 x petrol-daldırma amaç dilim anatomi sürekli neurites belirleyerek sağlamdır ve yapısı düzenlenmiş emin olmak için. MAP2 gibi nöronal bir işaretleyici ( şekil 1A) başvurmak.</li>
		<li>Daha sonra petrol-daldırma amaç x 60 geçin (NA ~1.3 - 1.4 =) ve en iyi sinyal ve kontrast elde etmek için her kanal ayarlarını. Bir yüksek- / düşük kontrast seçeneğini kullanarak herhangi bir piksel doygunluk kaçınmak için her lazer yoğunluğunu ayarlamak. 
		Not: Bu ayar kullanılan mikroskobunun bağlıdır ancak Şekil 2 ' de, şekil 3, kullanılan lazer güç ayarlarını için Malzemeler tablo bakın ve Şekil 4. En iyi sonuçlar için 1024 x 1024 piksel çözünürlük kullanın. Ayarları aynı deneyi farklı koşullar sabit kalması gerekir. Gerekirse ek zum yöneticilerini.</li>
		<li>Boyama nerede bile derinliği değerlendirmek ve görüntü yığınları en az 8 eşit uzaklıkta edinme (250 nm) uçaklar. O zaman dilim başına ilgi aynı alan 3 bitişik temsilcisi görüntüleri yığınları almak. 
		Not: Derinlik bir dilimden diğerine farklı olabilir ama her zaman dilimi yüzeyinden yaklaşık 2-5 µm olmalıdır.</li>
		<li>En az 3 dilim koşul başına ve tedavi grubu başına 6-8 hayvanlardan edinme yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>Görüntü analizi. 
	Not: otomatik görüntü analiz yazılımı kullanın (bkz. Tablo malzeme). Diğerleri gibi ImageJ ücretsizdir, ancak Not bazı sistemleri bir lisans gerektirir. Kullanılan yazılım görüntüsü yığının tüm uçaklar dikkate alarak görüntüleri 3D analiz gerekir. Görüntü analizi ( şekil 1) kullanılan yazılım ayrıntıları için Malzemeler tablo bakın.
	<ol>Tüm sinaptik puncta ve el ile en iyi duruma getirilmiş ve yazılım içinde seçili nöronal işaretleyicileri tanımlamak için <li>kullanım yoğunluğu özel tabanlı eşik Protokolü [Bu içinde kullanılan belirli yazılımlar için Tablo malzemeleri görmek protokol]. 
		Not: Yazılımın her fluorophore için bir minimum ve maksimum yoğunluk tanımlar ve yoğunluk tanınan her nesne için bir yüzdesi ilişkilendirir. Yoğunluk yüzdesi kullanılan fluorophore göre değişiklik gösterir Not ve sinaptik marker karşı antikor.</li>
		<li>Sinaptik işaretler için boyut filtreleri olun (&#62; 0.1µm 3 ve &#60; 0.8µm 3) yazılım içinde seçilir ve görüntüye uygulanan. Seçili nesneleri değil örtüşen emin olmak için parametreleri ayarlayın. Çok büyük veya çok küçük sinaptik puncta dikkate alınması gereken herhangi bir nesne hariç (bkz. şekil 2B). 
		Not: en iyi duruma getirilmiş bir kez aynı eşik değerleri daha sonra verilen deney içinde tüm görüntüleri uygulanır.</li>
		<li>Ölçmek ortalama sayısı, yoğunluk ve bireysel sinaptik puncta (öncesi ya da sonrası sinaptik) hacmi yazılım içinde seçilen en iyi duruma getirilmiş eşik protokolleri kullanarak. Resim alanı (kabaca 16,928 µm 3 ' te burada kullanılan sistem) hacmi puncta sayıya normalleştirmek. Sinaptik puncta yoğunluğu için başvuru nöronal marker yoğunluğunu normalleştirmek. 
		Not: Sinapslarda öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri arasındaki ortak yerelleştirme olarak tanımlanır. Bir kez öncesi ve sonrası sinaptik puncta h eşik iletişim kurallarıAve oldu kurulmuş, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sinaptik puncta co lokalizasyonu örtüşme 1 piksel veya daha fazla tek bir uçağı olarak belirlemelidir. 
		Not: istatistiksel analiz için tüm örnekleri kümesi normallik ve varyans, polimerlerin takip Lilliefords ve χ2 testleri, sırasıyla belirlenen onaylayın. Bir normal dağılım ve varyans polimerlerin gösteren örnekleri aşağıda açıklandığı gibi parametrik testler ile analiz edilmelidir. Örneğin, bir tek yönlü ANOVA kullanarak engelleme ve çoğaltma eksitatör sinaptik puncta analiz yapılmalıdır. Her bireysel deney bir taşı olarak düşünülmesi gereken; genellikle, çoğu üç bağımsız deneyler, her biri 1-3 fareler her durum.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Resim 1: sinaptik puncta görüntü analizi kullanılarak analizi yazılım. (a) Screenshot yoğunluğu eşik Protokolü özelleştirme. PSD-95, seçili puncta tanımlı bir boyutu var örnek verilmiştir olduğunu &#62; 0,1 µm 3 ve &#60; 0.8 µm 3 ve mevcut simge durumuna küçültülmüş örtüşen nesneler. Görüntü gösterilen bir confocal uçak daha kolay görsel olarak sinaptik puncta ve doğru parametre seçimi etkinleştirmek olduğunu unutmayın. (B) (en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı yelpazesi aşağıdaki) yazılım çıktı analizi ekran görüntüsü. Ham sinaptik puncta numara ölçümleri birim üzerinde temel bir örnek. Bu değerler daha sonra bir elektronik tablo yazılımı ihraç edilmektedir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Şekil 2: kalite kontrol sinaptik puncta dilim ve parametre ayarları. (A) temsilcisi confocal görüntüleri (40 x amaç) bölgenin ilgi: CA1 stratum radiatum (sr) ve tabaka oriens (yani) Hipokampal bir dilim tanımlanır MAP2 boyama tarafından. Ölçek çubuğu 2 µm. (B) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ve PSD-95 (kırmızı),-Hipokampal dilimleri üzerinden. Net öncesi ve sonrası sinaptik puncta tanımlaması unutmayın. Puncta 0.8 µm 3 daha büyük miktar (beyaz ok) hariç. Ölçek çubuğu 2 µm (C) Confocal resim = (60 x amaç ve bir ek 1.3 X büyütme edinme yazılım) CA1 stratum radiatum uyarıcı işaretler-vGlut1 (yeşil) ile-tüm beyin üzerinden cryostat kesimli Hipokampal bölümlerden PFA içinde sabit. Büyük delikler ve düzensiz, olmalı vGlut1 boyama varlığını unutmayın. Ölçek çubuğu 2 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Malenka, R. C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+and+LTD:+an+embarrassment+of+riches.">LTP and LTD: an embarrassment of riches.</a> Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).</li><li>Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+degeneration+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic degeneration in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).</li><li>Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+cell+adhesion.">Synaptic cell adhesion.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).</li><li>Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+an+excitatory+synapse.">The architecture of an excitatory synapse.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).</li><li>Dobie, F. A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synapse+dynamics:+coordinated+presynaptic+and+postsynaptic+mobility+and+the+major+contribution+of+recycled+vesicles+to+new+synapse+formation.">Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation.</a> J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).</li><li>Jackson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tau+increases+amyloid+beta+plaque+size+but+not+amyloid+beta-mediated+synapse+loss+in+a+novel+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease.</a> Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).</li><li>Heck, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+automated+3D+detection+of+synaptic+contacts+reveals+the+formation+of+cortico-striatal+synapses+upon+cocaine+treatment+in+vivo.">A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).</li><li>Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+levels+of+PSD95+and+two+associated+proteins+and+increased+levels+of+BCl2+and+caspase+3+in+hippocampus+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+Insights+into+their+potential+roles+for+loss+of+synapses+and+memory,+accumulation+of+Abeta,+and+neurodegeneration+in+a+prodromal+stage+of+Alzheimer's+disease.">Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).</li><li>Harwell, C. S., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptophysin+depletion+and+intraneuronal+Abeta+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+from+huAPP+transgenic+mice.">Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).</li><li>Marzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+Synapse+Degeneration+by+Restoring+Wnt+Signaling+in+the+Adult+Hippocampus.">Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus.</a> Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).</li><li>Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+dysfunction+in+neurodevelopmental+disorders+associated+with+autism+and+intellectual+disabilities.">Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).</li><li>Janezic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+dopaminergic+transmission+precede+neuron+loss+and+dysfunction+in+a+new+Parkinson+model.">Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).</li><li>Caricasole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Dickkopf-1,+a+negative+modulator+of+the+Wnt+pathway,+is+associated+with+neuronal+degeneration+in+Alzheimer's+brain.">Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain.</a> J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).</li><li>De Ferrari, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+genetic+variation+within+the+low-density+lipoprotein+receptor-related+protein+6+and+late-onset+Alzheimer's+disease.">Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).</li><li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+LRP6-mediated+Wnt+signaling+contributes+to+synaptic+abnormalities+and+amyloid+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease.</a> Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).</li><li>Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Secreted+Wnt+Antagonist+Dickkopf-1+Is+Required+for+Amyloid+beta-Mediated+Synaptic+Loss.">The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss.</a> J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).</li><li>Rosi, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Dickkopf-1+expression+in+transgenic+mouse+models+of+neurodegenerative+disease.">Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease.</a> J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).</li><li>Budnik, V., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+synaptic+development+and+plasticity.">Wnt signaling during synaptic development and plasticity.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).</li><li>Ciani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+tunes+neurotransmitter+release+by+directly+targeting+Synaptotagmin-1.">Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1.</a> Nat Commun. 6, 8302 (2015).</li><li>Dickins, E. M., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+in+action:+from+synapse+formation+to+synaptic+maintenance.">Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance.</a> Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).</li><li>Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+neuronal+differentiation+and+development.">Wnt signalling in neuronal differentiation and development.</a> Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).</li><li>Galli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+Wnt+signalling+triggers+striatal+synaptic+degeneration+and+impaired+motor+behaviour+in+adult+mice.">Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice.</a> Nat Commun. 5, 4992 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sinaps sayısı kesin değerlendirilmesi Nörolojik alana esastır. İşte, sinapslarda Hipokampal dilimleri CA1 stratum radiatum bölgede yoğunluk bir modeli sistem olarak değerlendirileceği nasıl göstermektedir. Mevcut yöntemler açısından önemi bizim son araştırma makalesinde Wnt eksikliği oluşur ve nerede Ayrıca synapse sayı değerlendirilip etkisi tek bölüm EM10tarafından gösterilmiştir. Sinaps zarar büyüklüğü tek bölüm EM ve beyin dilimli arasında benzer yöntem açıklanan burada10. Böylece, bu bulgu doğruluk ve güvenilirlik-in teknik gösterir.
Önemlisi, bir tek-bölüm EM ve burada anlatılan gibi immunostaining sinapslar, belirli beyin bölgesi için mutlak synapse numarası doğru tahmin yetersizlik kısıtlamasıdır. Gerçekten de, Toplam hacim değişiklikleri sinaptik numarası etkileyebilir gibi Genel morfolojik değişiklikleri belirlemek önemlidir. Belirli antikor olduğu gibi beyin bölgeleri, sinaptik bağlantıları aşırı yoğunluk nedeniyle kısmen boyama daha az verimli başka bir kısıtlamadır. Biz vGlut1 ve gephyrin en fazla 1 h, hemen tüm beyin PFA (şekil 2C) ve fiksasyonu ile karşılaştırıldığında bu dilim hazırlık ve sonraki PFA fiksasyon kullanarak daha yüksek kalitede boyama deneyimli. İkincisi olmalı sinaptik, delik doku ile boyama için yol açtı. Yine de, vGlut1 antikor penetrasyon hala her iki yöntem (mikron onlarca birkaç) sınırlıdır. Biz bu sınırlamayı aşmak değil, bile ile artan antikor kuluçka ama antikor penetrasyon sağlayarak yansıma toplam derinlik büyük, sonuç üzerinde herhangi bir etkisi olmalı. Ayrıca, özel boyama bile tüm alınan yığını olması için özen gösterilmelidir.
Bizim çalışmada, ayırt etmek inhibitör sinapslarda gelen eksitatör istedik. Bu proteinler yüksek yetişkin fare Hipokampus ifade edilir ve her synapse alt türü4,5' e özgü sonuç olarak, biz vGlut1/PSD-95 ve vGAT/gephyrin, sırasıyla, seçti. Diğer eksitatör ve inhibitör sinaptik işaretleri NMDA ve AMPA reseptör için de dahil olmak üzere her sinaps, zenginleştirilmiş reseptörleri gibi ilgili her synapse tanımlamak için kullanılan eksitatör ve inhibitör sinapslarda GABAA reseptörleri. Diğer nörotransmitter veya neuromodulators da belirli antikor dopaminerjik sinapslarda striatum22için gösterildiği gibi kullanılabilir, sağlamak bizim protokol ile tespit edilebilir. Ayrıca, 120 µm için her dilim kalınlığı azaltmak kısmen düşük miktar olan amigdala gibi küçük beyin yapıları araştırmaları zorunludur akut dilimleri ile elde edilen örneklerin üstesinden gelebilir.
Bizim Protokolü'nün gelecekteki uygulamalar farklı beyin bölgeleri ve bozuklukları çalışmada uygulamaya olabilir. Örneğin, striatum (Parkinson hastalığı ile ilişkili beyin bölgesi), vGlut2/PSD-95 veya vGlut1/PSD-95 afferents korteks veya talamus gelen gelen eksitatör sinapslarda arasında ayırt etmek için kullanılabilir, sırasıyla22.
Sonuç olarak, biz bir synapse tanımlamak için öncesi ve sonrası sinaptik işaretçileri kullanarak beyin dokularında sinapslarda sayısını incelemek için güvenilir bir yöntem göstermiştir. Kritik adımlar iyi Hipokampal dilimler, en fazla 1 saat PFA, yeterli montaj orta uygulanması, güvenilir antikor, uygun görüntü alma ayarları ve sıkı sinaptik puncta algılama kullanımı bir fiksasyon zaman hazırlanması içerir. Sonuçta, bu yöntem nispeten hızlı ve confocal mikroskop erişiminiz olan herhangi bir laboratuar tarafından kolayca tekrarlanabilir.

İnsan beyni yaklaşık 1014 sinapslarda oluşur. SYNAPSE numarası sıkı bir şekilde geliştirilmesi ve merkezi sinir sistemi (MSS) olgunlaşma sırasında düzenlenir. Geliştirme sinaps sayısı modüle synaptogenesis ve işlevsel nöron ağları oluşturmak için budama. Öğrenme ve hafıza synapse numarası ve gücü, sinaptik kullanılmasının muhtemelen ve depresyon1bilinen bir işlem Yönetmeliği tarafından desteklenir. Önemlisi, olgun sinapslarda istikrar nöronal ağ bağlantıları korumak için önemlidir. Ayrıca, açıkları synapse yoğunluğundaki nörodejeneratif koşulları Alzheimer hastalığı (Ah)2gibi erken aşamalarında bildirilmiştir. Bu nedenle, doğru bir şekilde belirlemek ve synapse numarası değerlendirmek için yetenek değerlendirme beyin fizyolojisi ve patoloji esastır.
Aşırı yoğunluk ve kompakt sinapslarda doğası yapmak o sağlam beyin alanlarda onların kesin sayısını tahmin etmek zor. MSS kimyasal sinapslar yakın appozisyon, bir sinaptik yarık3tarafından ayrılmış iki nöronlarda yapılır. Önceden sinaptik terminal veya sinaptik bouton, bir akson ortaya çıkar ve bir synapse özgüllük tanımlamak nörotransmitter içeren birikmiş veziküller oluşur — Yani, Glutamat ve gama - aminobütirikasit (GABA) için uyarıcı ve inhibitör synapses, anılan sıraya göre. Veziküller zarı veziküler taşıyıcılar için her nörotransmitter belirli içerir: Glutamat ve GABA veziküler GABA ışınlama (vGAT) için veziküler Glutamat ışınlama (vGlut). Post sinaptik terminal reseptörleri, adezyon molekülleri ve İskele proteinler de dahil olmak üzere birden çok proteinlerin oluşan son derece yoğun bir yapıdır. Eksitatör sinapslarda içinde post sinaptik yoğunluğu-95 protein (PSD-95) eksitatör N-methyl-D-aspartate(NMDA-) ve α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA-) reseptör modülasyonlu en bol iskele protein4olur işlev, ise inhibitör Post sinaptik terminal5inhibitör reseptörler gephyrin tutturur. Genel olarak, öncesi ve sonrası sinaptik bölmeleri protein özgüllük yardım farklılaşma ve synapse alt türlerinden tanımlaması.
Sinaps sayısı değerlendirilmesi farklı teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Elektron mikroskobu (EM), kompakt ve sağlam beyin alanlarda yüksek büyütme ve çözünürlük ile sinaps analizini sağlayan kullanımı yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu teknik çok pahalı, karmaşık numune hazırlama için ve çok zaman alıcıdır. Diğer teknikleri Çözümlemeyi gerçekleştirmek için özel ve pahalı donanımları gerektirir ki büyük bir dezavantajı vardır dizi tomografi6, kullanımını içerir. Ayrıca, transgenik hatları belirli sinaptik işaretleri ifade synapse sayı7, değerlendirilmesi yararlı, ancak yeni satırlar nesil kısıtlayıcı ve pahalı olabilir ve proteinlerin overexpression istenmeyen off-hedefini neden olabilir fenotipleri.
Bu sınırlamalar nedeniyle ve basitlik için pek çok araştırmacı sinaps sayısı toplam sinaptik protein düzeyleri incelenerek değerlendirin. Ancak, sinaps kaybı protein, önemli değişiklikler önce öncesi ya da sonrası sinaptik appozisyon, dağılma sinaptik proteinler hiçbir bozulma ile sinaptik remodeling sonuçlarında yapısal olarak görülebilir. Ayrıca, reklam, azaltılmış aşağıdaki synapse dejenerasyonu veya nöronal ölüm8,9sinaptik protein düzeyleri vardır. Toplam düzeyleri miktar bu ayrım etkinleştirmez. Böylece, beyin sinaps sayısında değerlendirilmesi için bir güvenilir, erişilebilir ve doğru yöntem geliştirmek için gerek yoktur.
Bu makalede, biz iyice tanımlamak ve Hipokampal kemirgen beyin dilimler halinde ayirt mikroskobu kullanılarak sinapslarda sayısını belirlemek nasıl açıklar. Sinapsların colocalization öncesi ve sonrası sinaptik işaretlerinin punctate bir dağıtım içinde görünen tarafından tanımlanır. Biz bu teknik Wnt sinyal beyinde incelenmesi yoluyla geçerliliğini göstermek. Wnts salgılanan proteinler önemli oluşumu, ortadan kaldırılması ve sinapslarda bakımı için önemlidir. Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), salgılanan antagonist vivo içinde indüksiyon Hipokampus10inhibitör sinapslarda koruyarak eksitatör sinaptik kaybına neden. Kimlik ve Dkk1 ifade bir yetişkin fareden Hipokampal dilimleri eksitatör ve inhibitör sinapslarda sayısını göstermek ve doku/kültür ürünleri diğer türleri için bu teknik Aktarılabilirliği vurgulayın.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

Beyinde, sinapslar arasındaki güç ve nöronal sinyal yaymak belirlenmesi, özel kavşaklar vardır. Sinapsların sayısı sıkıca geliştirme ve nöronal olgunlaşma sırasında düzenlenir. Önemlisi, açıkları sinaps sayısı için bilişsel işlev bozukluğu neden olabilir. Bu nedenle, sinaps sayısı değerlendirilmesi Nörobiyoloji ayrılmaz bir parçasıdır. Ancak, sinapslarda sağlam beynini küçük ve çok sık olarak, mutlak sayı değerlendirilmesi zordur. Bu iletişim kuralı kolayca tanımlamak ve sinapslarda ayirt mikroskobu kullanılarak Hipokampal kemirgen dilimleri içinde değerlendirmek için bir yöntem açıklanır. Bu yüksek kaliteli confocal mikroskobu görüntülerde sinapslarda Hipokampal dilimleri öncesi ve postsinaptik proteinlerin co yerelleştirme analiz ederek değerlendirmek için üç adım yordam içerir. Nasıl analiz gerçekleştirilir ve eksitatör ve inhibitör sinapslarda temsilcisi örnekler verir da açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı sinapslarda analiz için sağlam bir temel sağlar ve araştırma yapısı ve işlevi beynin herhangi bir araştırma için uygulanabilir.

SYNAPSE kaybı oluşur AD gibi nörodejeneratif hastalıklarda erken ve Parkinson hastalığı2,11,12. Ancak, bu açıkları temel moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Wnt sinyal içinde eksiklikleri reklam13,14,15,16,17ile ilişkilendirilmiştir. Wnts salgılanan glikoproteinlerin ve synapse oluşumu ve sinaptik iletimi18,19,20,21modülasyon önemli bir rol oynamak. Son zamanlarda, Wnts olgun sinir sistemi10,22sinaptik bakım anahtar düzenleyiciler olarak tanımlanan. Doğru bir şekilde genetik fareler Hipokampus sinapslarda üzerinde Wnt sinyal etkisi çalışma için biz bir beyin dilim hazırlık ve confocal mikroskobu synapse numarasındaki değişiklik değerlendirmek için kullandı. Biz sağlıklı dilimleri yapısı iyi tespit (şekil 2A) korunmuş. Ayrıca, sinaptik puncta yelpazesi dikkatle, muhtemelen toplanan proteinler (şekil 2B) temsil eden büyük lekeli nesneleri dışlama ile tanımlanmıştır. Bu ölçüt tüm görüntülerle aynı sıkı analiz parametrelerini uygulandı.
Biz yetişkin salgılanan Wnt antagonisti Dkk1 ifadesi indükler bir transgenik modeli sistemi kullanılan fare (iDkk1) tetrasiklin altında kontrol (bakınız Tablo reçetesi)10,22. Biz yetişkin Hipokampus Wnt sinyal abluka eksitatör synapse kaybı özellikle bölgede CA1 stratum radiatum (şekil 3) tetikler gösterdi. Şekil 3A temsilcisi confocal görüntüleri eksitatör öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri gösterilmektedir (vGlut1 ve PSD-95, sırasıyla) onların ilgili denetimlerin yanı sıra iki hafta için Dkk1 ifade iDkk1 farelerin Hipokampal dilimleri üzerinden satın aldı. Biz bu görüntüleri Volocity yazılım kullanarak analiz ve vGlut1 ve PSD-95-etiketli puncta takip iDkk1 farelerin Hipokampus CA1 bölgesindeki co yerelleştirme tarafından sayısal eksitatör sinapslarda sayısı önemli bir azalma gösterdi iki haftadır Dkk1, indüksiyon (şekil 3B, * p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). CA1 stratum radiatum eksitatör sinaps puncta numarası 1000 µm3 başına 500 denetim farelerde iDkk1 farelerde 300'e düşürüldü. Buna ek olarak, indüklenen Dkk1 ifade inhibitör sinapslarda (öncesi ve sonrası sinaptik işaretleri vGAT ve gephyrin, arasında ortak yerelleştirme sırasıyla, olarak tanımlanır) şekil 4A-B gösterilen sayısını etkilemez mi (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına).
Önemlisi, dilimleri ve hayvanlar sağlam bu sonuçlar üretmek için gereken uygun sayısını tahmin etmek için bir istatistiksel güç analizi yapılır. R kullanarak, biz koşul başına yaklaşık olarak 35 dilimleri ihtiyaç vardı hesaplanır (3 resim x 3 dilim x 6 hayvanlar 36 =) bir büyük etkisi boyutu algılamak için (f = 0,4) % 80 güven ile (güç 0.8 =) engelleme ve çoğaltma ile tek yönlü ANOVA içinde açıklandığı gibi adım 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Şekil 3: iDkk1 fareler gelen Hipokampal dilimleri içinde eksitatör sinapslarda kaybı. VGlut1 ve PSD-95 (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum gösteri eksitatör sinapslarda,(a)temsilcisi confocal görüntüleri. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm denetimi ve iDkk1 arasındaki eksitatör sinapslarda yüzdesi sayısal Malzemeler tablo içinde belirtilen yazılım kullanarak. (B) = (* p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 6 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Şekil 4: inhibitör sinapslarda iDkk1 fareler Hipokampal dilimler halinde değişmeden. (A)temsilcisi confocal görüntülerini inhibitör sinapslarda vGAT ve gephyrin (beyaz ok) arasında ortak yerelleştirme tarafından tanımlanmış CA1 stratum radiatum. Alt paneli daha yüksek büyütme vurgulu dikdörtgen temsil eder. Ölçek çubukları 2 µm. (B) = Volocity yazılımını kullanarak sayısal olarak kontrol ve iDkk1 fareler arasında inhibitör sinapslarda yüzdesi (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis testi; 3 fare genotip başına). Verileri temsil ± SEM vardır Bu rakam başvuru10değiştirildi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yüksek Sükroz ACSF bileşenleri</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Notlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic asit</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pirüvik asit</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glikoz</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sükroz</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batık odası ACSF bileşenleri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Çözüm oxygenation sonra Ekle</td>
		
		<tr>
			<td>D-glikoz</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tablo 1: ACSF kompozisyon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabellek engelleme/permeabilizing</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
			<td>Notlar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eşek serum</td>
			<td>% 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>% 0.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH 7,4 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>%4 PFA/4% sükroz</td>
			<td></td>
			<td>pH 7,4 için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>10 x sulandırmak</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İNGİLTERE'DE YILIN</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sükroz</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: immünfloresan boyama için kullanılan arabellekleri.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices at JoVE.com

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Görüntüleme.  University College London. Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Kayıt ve modülasyon Epileptiform aktivite elektrot dizilerin birleştiğinde kemirgen beyin dilimleri içinde

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...