Biz, teknik yardım için Rochester Tıp Merkezi Üniversitesi&#39;nden Elektron Mikroskobu Araştırma Core Tesisleri&#39;nde bir peristaltik pompa ve vibratome kullanımının yanı sıra, Karen L. Bentley ve Gayle Schneider Shao-Ming Lu ve Harris A. Gelbard teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Burroughs Wellcome Fonu ve AKM için Alfred P. Sloan Vakfı hibe tarafından finanse edildi. M.-È.T. Viyana de la recherche tr santé du Québec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir.

1. Hayvan perfüzyon <ol><li> Perfüzyon bir gün önce, hazırlamak: - 2 L fosfat tamponu (PB 100 mM, pH 7.4) ve 1 L sodyum fosfat tamponlu salin (PBS;% 0.9, 50 mM PB NaCl, pH 7.4) çift distile su. 4 PB PBS ve 1L ° C Mağaza Bu perfüzyon ve öncesi gömme immünsitokimya için kullanılacaktır. -% 4.0 paraformaldehid 1L (PFA, pH 7.4) fiksatif 6 farelerin perfüzyon sağlayacak bir çözüm. Bu amaçla, ısı davlumbaz altında PB 1 L. 40 g granül paraformaldehid (PFA) tartılır ve 60 ° C&#39;ye ulaştığında PB çözüm dökün Çözümü, 4 oda sıcaklığında (RT) ve mağaza serin PFA tamamen çözülmüş, ° C, açık olduğunda </li><li> Perfüzyon gününde, davlumbaz altında% 3,5 akrolein çözüm PB 500 mL hazırlamak. Daha sonra,% 3,5 akrolein ve filtre kağıdı kullanarak% 4.0 PFA çözümler filtresi. </li><li> 27 gauge ½ &quot;iğne ile periton içine fare anestezi için, sodyum pentobarbital (80 mg / kg) enjekte edilir. </li><li> Perfüzyon sırasında, 50 ml PBS, 75 ml, akrolein ve PFA 150 ml sırayla fare dolaşıma geçecek. Peristaltik pompa kurmak için boru, PBS ile doldurun ve bir ucunda 23 gauge ¾ &quot;kelebek iğne düzeltmek Hortumun diğer ucunu perfüzyon çözeltisi (PBS, acrolein veya PFA) içine daldırın. Peristaltik hızını ayarlama 20-25 ml / dk genç ve yetişkin farelerin pompası. perfüzyon boyunca dikkatli bir şekilde tüpün içinde oluşan hava kabarcıkları önlemek. </li><li> Devam etmeden önce, anestezi fare artık böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara yanıt verene kadar bekleyin. Diseksiyonu tepsi hayvan Lay ve bant kullanarak pençeleri düzeltmek. Cımbız ve makas ile deri ve göğüs boşluğunda kalp maruz açın. Beyin iskemi en aza indirmek için, perfüzyon hızla başlatılması gerekir. Sağ atrium küçük makas ile kesilerek açılır ve peristaltik pompa başlatmak. Cımbız ile kalp tutarken, sol ventrikül apeksi içine kelebek iğne takın. </li><li> Çözüm değişen zaman, peristaltik pompa durdurmak için başka bir çözüm tüp transferi ve pompa hemen yeniden başlatın. </li><li> 150 mL PFA zaman geçti, peristaltik pompa durdurun. Kullanarak, küçük bir makas, baş kesti cilt kadar açık ve gözler arasındaki kafatası kırmak. Beyin kolayca çıkarılabilir kadar küçük cımbız, kafatası küçük parçalar halinde kapalı dikkatle çip kullanılması. Beyin az 2 saat 4 Post-düzeltmek ° C PFA. PBS içinde 3 kez 10 dakika yıkayın. </li><li> Hemen bir vibratome kullanarak buz soğutmalı PBS içinde enine beyin (50 mikron kalınlığında kesitler) kesti. Ince bir fırça ile, PBS içeren bir cam şişenin içine immünsitokimya seçilen bölümleri aktarmak. Birkaç yıl öncesine kadar dölveriminin -20 ° C (% 30 etilen glikol ve PBS içinde% 30 gliserol) geri kalan bölümleri saklayın. </li></ol> 2. Ön-gömme immünsitokimya <ol><li> Immünhistokimya için, bölümler, cam şişe içinde serbestçe yüzen işlenir. Süreci boyunca, bir dikkatle bölümleri kurumasına izin kaçınmak gerekiyor. </li><li> Birincisi, bir transfer pipet kullanarak PBS çıkarın ve hemen yeni bir çözüm RT 30 dakika süreyle PBS içinde% 0.1 sodyum bor hidrür ile değiştirin. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika ile tüm kabarcıklar kaldırarak bölümleri durulayın ve% 0,5 jelatin ve ikincil antikor oluşturulduğu hayvan% 5 normal serum (normal keçi serum içeren PBS engelleyici bir çözüm oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe Iba1-immün mevcut örnek). </li><li> Çözümü engelleme birincil antikor ile 48 saat inkübe edin. Iba1-immün için, tavşan anti-Iba1 antikor (1:1000) kullanın. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 2 saat için çözüm engelleme biotin için konjuge sekonder antikor (1:1000) kuluçkaya yatmaktadır. Iba1-immün için, keçi anti-tavşan IgGs kullanın. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 1 saat için çözüm engelleme streptavidin horseradish peroksidaz (1:1000) inkübe. </li><li> PBS 10 dakika ile ve bölümleri HCI-tamponlu Tris / tuzlu su ile durulayın (TBS, 50 mM, pH 7.4) 2 kez 10 dakika. Etiketleme göstermek için,% 0.05 DAB ve TBS içinde% 0.01 hidrojen peroksit (taze hazırlanmış solüsyon) bölümleri kuluçkaya yatmaktadır. Boyama, koyu kahverengi (Şekil 1 örneğe bakın), TBS içinde durulayarak reaksiyon dur. Herhangi bir durumda, en fazla 5 dakika sonra reaksiyon sonunda. TBS 10 dakika ve PB 2 kez 10 dakikalık bölümlerde durulayın. </li></ol> 3. Elektron mikroskobu için işleme <ol><li> PB içine ince bir fırça kullanarak multiwell kültür plakasına bölümleri aktarın. Dumanlı kaputun altında PB% 1&#39;lik osmiyum tetroksit çözüm hazırlayın. Kültür plaka kuyulardan PB çıkarın ve<html> ince bir fırça ile düz bölümlere yayıldı. RT 30 dakika için% 1 osmiyum hemen batırmayın bölümleri. </li><li> Cam şişe içine bölümleri Transferi, PB 3 kez 10 dakika ile temizleyin, durulayın ve etanol konsantrasyonları artan içine 2 dakikalık daldırma yoluyla kurutmak: 2 kez% 35, 1 kez% 50,% 70,% 80,% 90, ve 95 % 3 kez propilen oksit tarafından% 100 3 kez. </li><li> Durcupan reçine hazırlamak için, tek renk olana kadar A, B bileşeni 20 g, 0.6 g bileşeni C, ve 0.4 g tek bir behere bileşeni D iyice karıştırın, 20 gr bileşen birleştirmek ve ağırlığında bir alüminyum dökün çanak. Gerekirse, reçine blokları, reçine kalıplar gömme ve 48-72 saat süreyle 55 ° C fırında kür içine dökerek hazırlanabilir. </li><li> Propilen oksit ile durulanır ince bir fırça kullanarak, RT gecede Durcupan reçine emprenye propilen oksit ve batırmayın bölümleri çıkarmak. </li><li> Ertesi gün, alüminyum reçine yumuşatmak için 10 dakika boyunca 55 ° C fırında çanak tartmak koydu. Propilen oksit, mont ince bir tabaka reçine ile bir ACLAR gömme filmi ile durulanır bir fırça kullanarak, başka bir gömme film ile kaplar ve eşit olarak (örneğin cam şişe, plastik kapaklar g yaklaşık 2) hafif ağırlıklarla dağıtmak, bölümler uzandı üstüne reçine yayılmasına yardım. Reçine polimerizasyon için, 48-72 saat (55 ° C) fırında kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Polimerizasyon sonra, bölümleri üst üste hafif ağırlıklarla ve gömme filmi çıkarın. Binoküler mikroskop altında (2x2 mm) kare ilgi alanları seçin ve bunları dikkatli bir şekilde tüketim jilet kullanarak film. </li><li> Tutkal superglue kullanarak reçine blokları ucunda ilgi alanları ve 55 ° C fırında 1 saat süreyle kür. </li><li> Kesit hazırlık, bir jilet ile bir ikizkenar yamuk şeklindeki reçine blok kırpın. </li><li> Ultramicrotome ve bir bardak bıçak kullanarak, doku yüzeyine tutkal ve reçine çıkarmak. Cam bıçak tekne çift distile su ile doldurun ve bir kaç yarı ince kesitler (0.5-1 mikron kalınlığında) kesmek. </li><li> Mükemmel bir döngü ile bir SuperFrost slayt bölümleri aktarın. 1 dakika için 80 ° C ısıtma plakası üzerinde slayt koyarak bölümlerde kurulayın. 1 dakika boyunca% 0.1 toluidin mavi leke (2 g sodyum borat ve 200 ml çift distile su ile 0.2 g toluidin mavi) birkaç damla ile kaplayın. Çift distile su ile boya aşan durulayın. Bölümlerde ışık mikroskobu ile incelenmesi reçine (Şekil 2) lekeli doku ayırt etmek sağlayacaktır. </li><li> Doku ve reçine arasındaki sınır bölümden orta ulaşana kadar kesme sürdürün. Aşağıdaki yordamı eğitim gerektirir unutmayın. Elmas bıçak ile bıçak cam değiştirin ve tekne çift distile su ile doldurun. Gümüş-altın ultra ince bölümler (60-80 nm kalınlığında) gümüş kesin ve ince ters cımbız kullanarak bakır örgü ızgaralar üzerinde dikkatle onları toplamak. Kuru bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları. </li><li> Kontrastı arttırmak için, ultra ince kesitler kurşun sitrat (0,03 g kurşun sitrat ve 0,1 ml 10N sodyum hidroksit 10 ml çift distile su 1) ile boyandı. Ince ters cımbız kullanarak, 2 dakika boyunca kurşun sitrat bir damla için bir kılavuz aktarın. Izgara çıkarın ve ince, çift distile su ile art arda 3 hamam ile durulayın. Son olarak, bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları kuru ve elektron mikroskopik inceleme (Şekil 3-6) kadar bir ızgara kutusunda saklayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 ışık mikroskobu düzeyinde Iba1 lekeli bölümü. Iba1 hücresel dağılımı immün özgüllüğü gösterir mikroglia, sınırlıdır. Ölçeği bar = 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 ışık mikroskobik düzeyde. Toluidine mavi boyanan yarı ince kesit. Immün elektron mikroskobu en yoğun görünecektir doku ve reçine arasındaki sınır unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Elektron mikroskobik düzeyde Iba1 immünopozitif mikrogliyal perikaryon ve süreçleri gösteren Şekil 3 Ultrathin bölüm. Iba1 pozitif yapısal elemanların immunoperoksidaz-DAB elektron-yoğun çökelti tarafından kabul edilmektedir. Ölçek çubuğu = 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Elektron mikroskobik düzeyde farklı ebat ve şekillerde Iba1 immünopozitif mikrogliyal süreçleri gösteren Şekil 4 Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 2 mm. E 5 &quot;/&gt; Şekil 5, hücre içi organellerin kimlik sağlayan, yüksek büyütmede Şekil 4 Iba1 pozitif mikrogliyal süreci gösteren Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 Ultrathin bölümünde yüksek büyütmede ultrastrüktürel bir Iba1 pozitif mikrogliyal süreci ve sinapsların da dahil olmak üzere neuropil Yakın unsurları arasındaki ilişkileri ortaya çıkaran . Ölçeği bar = 1 mikrona kadar.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Burada, en iyi ultrastrüktürel korunması ve prosedürleri titizlikle yapılmaktadır immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar immunoelectron mikroskopi için fare beyin doku hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. TEM ile birlikte, bu yöntem, birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri ile hücresel öğeleri ayırt etmek sağlar. Özellikle, Iba1 immunoperoksidaz-DAB boyama neuropil içinde mikroglia perikarya ve süreçleri tanımlama...

* Bir davlumbaz altında her zaman çalışmak ve acrolein, paraformaldehid ve osmiyum ele alınması ve düzgün bir şekilde kendi atık imha nitril eldiven giymeli.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), merkezi sinir sistemi, mikroglia, oligodendrocytic astrositik ve nöronal hücre içi bölmeleri (dendrit dendritik omurga, akson, akson terminali, perikaryon) yanı sıra, bunların hücre içi organelleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için son derece yararlı yüksek uzaysal çözünürlük. Olarak sunulan; TEM ile birlikte, ön gömme immünsitokimya birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri (örneğin, mikroglia perikarya ve süreçleri, mikroglia özel işaretleyici Iba1 (iyonize kalsiyum bağlama adaptörü molekülü 1 karşı bir antikor kullanarak hücresel elemanların ayrımcılık sağlar burada)), nörotransmitter olarak hücresel elementler içeriği (örneğin, serotonerjik) ve ultrastrüktürel çözünür ve membrana bağlı proteinler lokalizasyonu (örneğin, 5 HT1A ve EphA4 reseptörler) belirlenmesi. Burada, akrolein fiksatörü, beyin bölümlerinin kaldırılması kesit ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz-diaminobenzidin (DAB), boyama, reçine gömme ve ultra ince fareler transcardiac perfüzyon için bir protokol açıklar. Ile immunohistokimyasal malzeme bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, TEM ile inceleme için hazırdır. Titizlikle yapılan zaman, bu tekniğin optimal ultrastrüktürel koruma ve immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K Görüntüleme.  University of Rochester. Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Nörobilim

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler