Biz, teknik yardım için Rochester Tıp Merkezi Üniversitesi&#39;nden Elektron Mikroskobu Araştırma Core Tesisleri&#39;nde bir peristaltik pompa ve vibratome kullanımının yanı sıra, Karen L. Bentley ve Gayle Schneider Shao-Ming Lu ve Harris A. Gelbard teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Burroughs Wellcome Fonu ve AKM için Alfred P. Sloan Vakfı hibe tarafından finanse edildi. M.-È.T. Viyana de la recherche tr santé du Québec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir.

1. Hayvan perfüzyon <ol><li> Perfüzyon bir gün önce, hazırlamak: - 2 L fosfat tamponu (PB 100 mM, pH 7.4) ve 1 L sodyum fosfat tamponlu salin (PBS;% 0.9, 50 mM PB NaCl, pH 7.4) çift distile su. 4 PB PBS ve 1L ° C Mağaza Bu perfüzyon ve öncesi gömme immünsitokimya için kullanılacaktır. -% 4.0 paraformaldehid 1L (PFA, pH 7.4) fiksatif 6 farelerin perfüzyon sağlayacak bir çözüm. Bu amaçla, ısı davlumbaz altında PB 1 L. 40 g granül paraformaldehid (PFA) tartılır ve 60 ° C&#39;ye ulaştığında PB çözüm dökün Çözümü, 4 oda sıcaklığında (RT) ve mağaza serin PFA tamamen çözülmüş, ° C, açık olduğunda </li><li> Perfüzyon gününde, davlumbaz altında% 3,5 akrolein çözüm PB 500 mL hazırlamak. Daha sonra,% 3,5 akrolein ve filtre kağıdı kullanarak% 4.0 PFA çözümler filtresi. </li><li> 27 gauge ½ &quot;iğne ile periton içine fare anestezi için, sodyum pentobarbital (80 mg / kg) enjekte edilir. </li><li> Perfüzyon sırasında, 50 ml PBS, 75 ml, akrolein ve PFA 150 ml sırayla fare dolaşıma geçecek. Peristaltik pompa kurmak için boru, PBS ile doldurun ve bir ucunda 23 gauge ¾ &quot;kelebek iğne düzeltmek Hortumun diğer ucunu perfüzyon çözeltisi (PBS, acrolein veya PFA) içine daldırın. Peristaltik hızını ayarlama 20-25 ml / dk genç ve yetişkin farelerin pompası. perfüzyon boyunca dikkatli bir şekilde tüpün içinde oluşan hava kabarcıkları önlemek. </li><li> Devam etmeden önce, anestezi fare artık böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara yanıt verene kadar bekleyin. Diseksiyonu tepsi hayvan Lay ve bant kullanarak pençeleri düzeltmek. Cımbız ve makas ile deri ve göğüs boşluğunda kalp maruz açın. Beyin iskemi en aza indirmek için, perfüzyon hızla başlatılması gerekir. Sağ atrium küçük makas ile kesilerek açılır ve peristaltik pompa başlatmak. Cımbız ile kalp tutarken, sol ventrikül apeksi içine kelebek iğne takın. </li><li> Çözüm değişen zaman, peristaltik pompa durdurmak için başka bir çözüm tüp transferi ve pompa hemen yeniden başlatın. </li><li> 150 mL PFA zaman geçti, peristaltik pompa durdurun. Kullanarak, küçük bir makas, baş kesti cilt kadar açık ve gözler arasındaki kafatası kırmak. Beyin kolayca çıkarılabilir kadar küçük cımbız, kafatası küçük parçalar halinde kapalı dikkatle çip kullanılması. Beyin az 2 saat 4 Post-düzeltmek ° C PFA. PBS içinde 3 kez 10 dakika yıkayın. </li><li> Hemen bir vibratome kullanarak buz soğutmalı PBS içinde enine beyin (50 mikron kalınlığında kesitler) kesti. Ince bir fırça ile, PBS içeren bir cam şişenin içine immünsitokimya seçilen bölümleri aktarmak. Birkaç yıl öncesine kadar dölveriminin -20 ° C (% 30 etilen glikol ve PBS içinde% 30 gliserol) geri kalan bölümleri saklayın. </li></ol> 2. Ön-gömme immünsitokimya <ol><li> Immünhistokimya için, bölümler, cam şişe içinde serbestçe yüzen işlenir. Süreci boyunca, bir dikkatle bölümleri kurumasına izin kaçınmak gerekiyor. </li><li> Birincisi, bir transfer pipet kullanarak PBS çıkarın ve hemen yeni bir çözüm RT 30 dakika süreyle PBS içinde% 0.1 sodyum bor hidrür ile değiştirin. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika ile tüm kabarcıklar kaldırarak bölümleri durulayın ve% 0,5 jelatin ve ikincil antikor oluşturulduğu hayvan% 5 normal serum (normal keçi serum içeren PBS engelleyici bir çözüm oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe Iba1-immün mevcut örnek). </li><li> Çözümü engelleme birincil antikor ile 48 saat inkübe edin. Iba1-immün için, tavşan anti-Iba1 antikor (1:1000) kullanın. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 2 saat için çözüm engelleme biotin için konjuge sekonder antikor (1:1000) kuluçkaya yatmaktadır. Iba1-immün için, keçi anti-tavşan IgGs kullanın. </li><li> PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 1 saat için çözüm engelleme streptavidin horseradish peroksidaz (1:1000) inkübe. </li><li> PBS 10 dakika ile ve bölümleri HCI-tamponlu Tris / tuzlu su ile durulayın (TBS, 50 mM, pH 7.4) 2 kez 10 dakika. Etiketleme göstermek için,% 0.05 DAB ve TBS içinde% 0.01 hidrojen peroksit (taze hazırlanmış solüsyon) bölümleri kuluçkaya yatmaktadır. Boyama, koyu kahverengi (Şekil 1 örneğe bakın), TBS içinde durulayarak reaksiyon dur. Herhangi bir durumda, en fazla 5 dakika sonra reaksiyon sonunda. TBS 10 dakika ve PB 2 kez 10 dakikalık bölümlerde durulayın. </li></ol> 3. Elektron mikroskobu için işleme <ol><li> PB içine ince bir fırça kullanarak multiwell kültür plakasına bölümleri aktarın. Dumanlı kaputun altında PB% 1&#39;lik osmiyum tetroksit çözüm hazırlayın. Kültür plaka kuyulardan PB çıkarın ve<html> ince bir fırça ile düz bölümlere yayıldı. RT 30 dakika için% 1 osmiyum hemen batırmayın bölümleri. </li><li> Cam şişe içine bölümleri Transferi, PB 3 kez 10 dakika ile temizleyin, durulayın ve etanol konsantrasyonları artan içine 2 dakikalık daldırma yoluyla kurutmak: 2 kez% 35, 1 kez% 50,% 70,% 80,% 90, ve 95 % 3 kez propilen oksit tarafından% 100 3 kez. </li><li> Durcupan reçine hazırlamak için, tek renk olana kadar A, B bileşeni 20 g, 0.6 g bileşeni C, ve 0.4 g tek bir behere bileşeni D iyice karıştırın, 20 gr bileşen birleştirmek ve ağırlığında bir alüminyum dökün çanak. Gerekirse, reçine blokları, reçine kalıplar gömme ve 48-72 saat süreyle 55 ° C fırında kür içine dökerek hazırlanabilir. </li><li> Propilen oksit ile durulanır ince bir fırça kullanarak, RT gecede Durcupan reçine emprenye propilen oksit ve batırmayın bölümleri çıkarmak. </li><li> Ertesi gün, alüminyum reçine yumuşatmak için 10 dakika boyunca 55 ° C fırında çanak tartmak koydu. Propilen oksit, mont ince bir tabaka reçine ile bir ACLAR gömme filmi ile durulanır bir fırça kullanarak, başka bir gömme film ile kaplar ve eşit olarak (örneğin cam şişe, plastik kapaklar g yaklaşık 2) hafif ağırlıklarla dağıtmak, bölümler uzandı üstüne reçine yayılmasına yardım. Reçine polimerizasyon için, 48-72 saat (55 ° C) fırında kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Polimerizasyon sonra, bölümleri üst üste hafif ağırlıklarla ve gömme filmi çıkarın. Binoküler mikroskop altında (2x2 mm) kare ilgi alanları seçin ve bunları dikkatli bir şekilde tüketim jilet kullanarak film. </li><li> Tutkal superglue kullanarak reçine blokları ucunda ilgi alanları ve 55 ° C fırında 1 saat süreyle kür. </li><li> Kesit hazırlık, bir jilet ile bir ikizkenar yamuk şeklindeki reçine blok kırpın. </li><li> Ultramicrotome ve bir bardak bıçak kullanarak, doku yüzeyine tutkal ve reçine çıkarmak. Cam bıçak tekne çift distile su ile doldurun ve bir kaç yarı ince kesitler (0.5-1 mikron kalınlığında) kesmek. </li><li> Mükemmel bir döngü ile bir SuperFrost slayt bölümleri aktarın. 1 dakika için 80 ° C ısıtma plakası üzerinde slayt koyarak bölümlerde kurulayın. 1 dakika boyunca% 0.1 toluidin mavi leke (2 g sodyum borat ve 200 ml çift distile su ile 0.2 g toluidin mavi) birkaç damla ile kaplayın. Çift distile su ile boya aşan durulayın. Bölümlerde ışık mikroskobu ile incelenmesi reçine (Şekil 2) lekeli doku ayırt etmek sağlayacaktır. </li><li> Doku ve reçine arasındaki sınır bölümden orta ulaşana kadar kesme sürdürün. Aşağıdaki yordamı eğitim gerektirir unutmayın. Elmas bıçak ile bıçak cam değiştirin ve tekne çift distile su ile doldurun. Gümüş-altın ultra ince bölümler (60-80 nm kalınlığında) gümüş kesin ve ince ters cımbız kullanarak bakır örgü ızgaralar üzerinde dikkatle onları toplamak. Kuru bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları. </li><li> Kontrastı arttırmak için, ultra ince kesitler kurşun sitrat (0,03 g kurşun sitrat ve 0,1 ml 10N sodyum hidroksit 10 ml çift distile su 1) ile boyandı. Ince ters cımbız kullanarak, 2 dakika boyunca kurşun sitrat bir damla için bir kılavuz aktarın. Izgara çıkarın ve ince, çift distile su ile art arda 3 hamam ile durulayın. Son olarak, bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları kuru ve elektron mikroskopik inceleme (Şekil 3-6) kadar bir ızgara kutusunda saklayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 ışık mikroskobu düzeyinde Iba1 lekeli bölümü. Iba1 hücresel dağılımı immün özgüllüğü gösterir mikroglia, sınırlıdır. Ölçeği bar = 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 ışık mikroskobik düzeyde. Toluidine mavi boyanan yarı ince kesit. Immün elektron mikroskobu en yoğun görünecektir doku ve reçine arasındaki sınır unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Elektron mikroskobik düzeyde Iba1 immünopozitif mikrogliyal perikaryon ve süreçleri gösteren Şekil 3 Ultrathin bölüm. Iba1 pozitif yapısal elemanların immunoperoksidaz-DAB elektron-yoğun çökelti tarafından kabul edilmektedir. Ölçek çubuğu = 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Elektron mikroskobik düzeyde farklı ebat ve şekillerde Iba1 immünopozitif mikrogliyal süreçleri gösteren Şekil 4 Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 2 mm. E 5 &quot;/&gt; Şekil 5, hücre içi organellerin kimlik sağlayan, yüksek büyütmede Şekil 4 Iba1 pozitif mikrogliyal süreci gösteren Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 Ultrathin bölümünde yüksek büyütmede ultrastrüktürel bir Iba1 pozitif mikrogliyal süreci ve sinapsların da dahil olmak üzere neuropil Yakın unsurları arasındaki ilişkileri ortaya çıkaran . Ölçeği bar = 1 mikrona kadar.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Burada, en iyi ultrastrüktürel korunması ve prosedürleri titizlikle yapılmaktadır immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar immunoelectron mikroskopi için fare beyin doku hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır. TEM ile birlikte, bu yöntem, birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri ile hücresel öğeleri ayırt etmek sağlar. Özellikle, Iba1 immunoperoksidaz-DAB boyama neuropil içinde mikroglia perikarya ve süreçleri tanımlama...

* Bir davlumbaz altında her zaman çalışmak ve acrolein, paraformaldehid ve osmiyum ele alınması ve düzgün bir şekilde kendi atık imha nitril eldiven giymeli.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), merkezi sinir sistemi, mikroglia, oligodendrocytic astrositik ve nöronal hücre içi bölmeleri (dendrit dendritik omurga, akson, akson terminali, perikaryon) yanı sıra, bunların hücre içi organelleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için son derece yararlı yüksek uzaysal çözünürlük. Olarak sunulan; TEM ile birlikte, ön gömme immünsitokimya birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri (örneğin, mikroglia perikarya ve süreçleri, mikroglia özel işaretleyici Iba1 (iyonize kalsiyum bağlama adaptörü molekülü 1 karşı bir antikor kullanarak hücresel elemanların ayrımcılık sağlar burada)), nörotransmitter olarak hücresel elementler içeriği (örneğin, serotonerjik) ve ultrastrüktürel çözünür ve membrana bağlı proteinler lokalizasyonu (örneğin, 5 HT1A ve EphA4 reseptörler) belirlenmesi. Burada, akrolein fiksatörü, beyin bölümlerinin kaldırılması kesit ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz-diaminobenzidin (DAB), boyama, reçine gömme ve ultra ince fareler transcardiac perfüzyon için bir protokol açıklar. Ile immunohistokimyasal malzeme bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, TEM ile inceleme için hazırdır. Titizlikle yapılan zaman, bu tekniğin optimal ultrastrüktürel koruma ve immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K Görüntüleme.  University of Rochester. Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.

Video: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Nörobilim

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Fare Beyni Hipokampal Dokusunun Kombine Mekanik ve Enzimatik Ayrışması

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Sağlam Fare ve Zebra Balığı Beyinde Derin Doku Üç Fotonlu Floresan Mikroskopisi

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Superior Colliculus'ta İki Foton ve Geniş Alan Kalsiyum Görüntüleme

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Yazar Gündemi: Superior Colliculus'ta Nöral Kodlamanın ve Görsel İşleme Mekanizmalarının Ortaya Çıkarılması 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...