Yöntemimizin önemi, soruyu cevaplama yeteneğinde yatmaktadır, zonular liflerin viskoelastik özellikleri nelerdir, göz içindeki lensi askıya alan lifler? Tekniğimizin ana avantajı, hedefli gen modifikasyonları olan ve olmayan farelerden gelen küçük ve hassas zonular liflerin viskoelastik özelliklerini ölçebilmesidir. Mikrofibril proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, kalıtsal birkaç syndromik koşulun altında yatırmaktadır.
Tekniğimizi kullanarak, spesifik mutasyonların mikrofibrillerin biyomekanik özelliklerini nasıl değiştirdiğini araştırabiliriz. Başlamak için, fareyi ötenazi sonrası, ince tokmaklar kullanarak gözleri çıkarın. Bir fiksasyon iğnesinin ucunu gözün duvarına yerleştirin ve lense zarar vermemeye dikkat ederek vitreus mizahının ortasına yerleştirin.
Saplanmış gözü% 4 paraformaldehit ve fosfat tamponlu salin ile dolu bir tüpe dikkatlice aktarın. İğneyi, sabitleme süresi boyunca göz içinde 15 ila 20 milimetre cıvaya eşdeğer pozitif basınç sağlayan numunenin 25 santimetre üzerinde bulunan sabitlenmiş bir rezervuara bağlayan vanayı açın ve numuneyi bir gecede sabitlemek için bırakın. Ertesi gün, fiksasyon iğnesini çıkarın ve gözü fosfat tamponlu salin içinde 10 dakika yıkayın.
Oftalmik cerrahi makas ve stereo mikroskop kullanarak, optik sinir kafasının yakınındaki göz duvarında tam kalınlıkta bir kesi yapın. Hassas silier işlemleri ve ilişkili zonular lifleri dikkatlice tutarken, kesimi ekvatora doğru ve daha sonra gözün ekvatoral çevresine doğru uzatın. Dünyanın arkasını çıkararak lensin arka yüzeyini açığa çıkarın.
Parçalanmış gözü forseps kullanarak tampon çözeltisinden çıkarın ve kornea aşağı bakacak şekilde kuru bir görev mendilinin üzerine yerleştirin. Korneayı kurutmak için silecek yüzeyinin üzerine hafifçe sürükleyin. 50 milimetrelik Petri kabının dibine bir damla anında tutkal uygulayın ve platformu sabitlayın.
Kabı stereo mikroskobun sahne plakasına yerleştirin, böylece tutkallı kuyu görüntülenir. Gözü Petri kabının platform kuyularına yerleştirmek için üç mikrolitre anında tutkal ekleyin. Dikkatlice kuyuya yerleştirin ve lensin arkası yukarı doğru dönecek şekilde hızla ayarlayın.
Lensin açıkta kalan tarafını kuru bir silmenin köşesiyle hafifçe şişirerek kurulayın. Zonular viskoelastik tepkiyi ölçmek için teraziyi açın, Petri kabını tartıya yerleştirin, ardından ölçek günlüğü programını ve kamera yazılımını başlatın. Servomotor kumandasını aç.
Bilgisayarda denetleyici uygulamasını başlatın ve hareket parametrelerini 50 mikrometre artışlarla ayarlayın. Kılcal çubukta 90 derece büküm oluşturun. Bükülmüş kılcal damarı kılcal prob tutucusuna kaydırın ve sabitleme vidalarını sıkın.
Kılcal uçlara küçük bir UV kürleme tutkalı ekleyin. Manipülatördeki manuel ayarlamaları kullanarak kılcal probun ucunu hareket ettirİn ve doğrudan lensin üstüne yerleştirin. Ön görsel inceleme ve mikroskop kamerası kullanarak yan görünüm sayesinde, UV tutkalının alt kısmının lensin üst kısmına ortalanmış olarak göründüğünü inceleyin.
Kameradan bakarken, UV tutkal lensle temas edene ve üst yüzeyinin 1/3 ila 1/2'sini kaplayana kadar prob ucunu küt atlayın. Tutkal, 380 ila 400 nanometre dalga boyu yöne yakın bir UV ışık kaynağı ve yaklaşık bir miliwatt yoğunluk kullanarak kürlayın. Göz en az iki milimetre derinliğe kadar kaplanana kadar Petri kabına PBS çözeltisi ekleyin.
Mikroskobun önüne ve Petri kabına dokunmadan yakın bir şekilde silindirik bir lens yerleştirin. Aynı zamanda, bir zamanlayıcı programında günlüğe kaydetmeyi başlatın. Kamerayı kullanarak gözün ve sondanın fotoğrafını çekin.
60 saniye sonra, 50 mikrometre yer değiştirmeye başlayın. Deney tamamlanana kadar her 60 saniyede bir tekrarlayın, tüm zonular liflerin kırılmasıyla belirtildiği gibi. Bir çalıştırma tamamlandıktan sonra ölçek günlüğü verilerini kaydedin ve uyumlu bir elektronik tablo biçimine verin.
Ayrıca, çalıştırma sırasında elde edilen lens resimlerini kaydedin. Verileri elektronik tabloya alın. İlk ve son ölçek okumasını kullanarak, buharlaşma nedeniyle zaman içinde arka plan okumasındaki sürüklenmeyi enterpolasyona tabi edin, ardından enterpolasyonlu arka planı her zaman noktasında okumadan çıkarın.
Tahlil yapıldıktan ve buharlaşma için düzeltildikten sonra, viskoelastik verilerin grafiği ters çevrilir. Anlık ve rahat kuvvetlerin büyüklüğü, yaklaşık 1.000 saniyeye kadar her adımda artar, daha sonra zonular lifler tüm lifler kırıldığında 1.500 saniyelik zaman noktasına ulaşılana kadar kırılmaya başladığında düşer. Bu gösteri için, vahşi tip ve MAGP-1 eksikliği olan fareler için viskoelastik yanıt da karşılaştırıldı.
Sıfır ila 600 saniyelik ilk zamanda, grafikler birbirine benzer ve zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin önemli ölçüde değiştirilmediğini düşündürür. Bununla birlikte, MAGP-1 nakavt faresinde, lifler zamanından önce kırılır. Zonular lif kırma kuvvetleri, magp-1 için bir aylık ve bir yıllık aşamalarda vahşi tip farelere karşı barfiks yöntemi ile elde edildi.
Sonuçlar, liflerin gücünün yabani tip fareler için yaşla birlikte arttığını gösterdi. Bu adımlar sırasında Petri kabı ile herhangi bir yanlışlıkla temas, göz duvarının göz merceğine göre kaymasına neden olabilir ve zonular liflere zarar verebilir. Bu barfibril tahlil, mikrofibrillerin gerilme mukavemetine katkıda bulunan proteinlerin tanımlanmasına yardımcı olur.
Bu bilgileri, zonular liflerin iç kısmının daha gerçekçi modellerini oluşturmak için kullanacağız.
