Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir nanoindenter kullanarak hidrojellerin ve hücrelerin sertliğini ölçmek için adım adım bir kılavuz gösterir ve ayrıca elde edilen verileri yeniden üretilebilir bir şekilde analiz etmek için açık kaynaklı bir yazılım sunar. Protokol, atomik kuvvet mikroskobu benzeri verileri, karmaşıklığın bir kısmında, elde etmemizi sağlar. Bu nedenle, bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı örneklerin mekanik özelliklerini incelemek isteyen bilim adamları için yararlı olacaktır, ancak aynı zamanda yumuşak malzemeler için nanogirinti bağlamında daha geniş uygulanabilirliğe sahip olacağına inanıyoruz.
Cihazı açtıktan ve deney için seçilen probu monte ettikten sonra, probu kalibre etmeye başlayın. Ana yazılım penceresinde Başlat'a tıklayın. Görüntülenen Kalibrasyon Menüsü'nde, giriş kutularına prob ayrıntılarını girin.
Daha sonra, kalın, cam bir Petri kabını, numune kabıyla aynı ortama sahip düz bir tabanla doldurun ve ortamın sıcaklığını numuneninkiyle eşleştirin. Ardından, kalibrasyon kabını probun altına yerleştirin. Sıvıda kalibrasyon için, probu, pipetin ucu cam yüksükle hafif temas halinde% 70 etanol veya izopropanol damlasıyla, damla konsol ve küresel uç üzerinde kayacak şekilde önceden ıslatın.
Daha sonra, nanoindenter'ın kolunu, prob tamamen suya batırılana kadar, ancak Petri kabının dibinden hala uzakta olana kadar manuel olarak aşağı doğru kaydırın. Sıvıda denge koşullarına ulaşılabilmesi için beş dakika bekleyin. Ardından, yazılımın Başlat Menüsünde, Dalga Boyunu Tara'ya tıklayın.
İnterferometrenin ekranında bir ilerleme çubuğu gösterilir. İnterferometre kutusundaki Dalga Boyu Taraması paneline giderek optik taramanın başarılı olup olmadığını kontrol edin. Ardından, Başlat Menüsünde, probu aşamalı olarak azaltmak için Yüzeyi Bul'a tıklayın.
Prob, cam Petri kabına temas ettiğinde hareket etmeyi durdurur. Prob yüzeyle temas ettiğinde, ana yazılım penceresindeki y aşağı doğru ok düğmesini kullanarak probu bir mikrometre aşağı doğru hareket ettirin. Her bir mikrometrelik adımda taban çizgisindeki değişiklikler için canlı penceredeki yeşil sinyali gözlemleyin.
Ardından, Başlat Menüsü'nden Kalibre Et'i tıklatın. Kalibrasyon tamamlandığında, görüntülenen açılır pencerede eski ve yeni kalibrasyon faktörlerini kontrol edin. Yeni kalibrasyon faktörü, makalede açıklandığı gibi doğru aralıktaysa, Yeni Faktör Kullan'a tıklayın.
Ardından, piezo'yu 500 mikrometre yukarı doğru hareket ettirin. Ardından, interferometre masaüstündeki Demodülasyon sekmesine giderek demodülasyon çemberinin doğru şekilde kalibre edilip edilmediğini kontrol edin. Yeterli gürültüyü tetiklemek için optik masaya veya nanoindenter'a hafifçe dokunun.
Ayrık veri noktalarından oluşan beyaz bir daire, kırmızı daireyi yaklaşık olarak örtmelidir. Numuneyi içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yükleyin ve nanoindenterin probunu numunenin üzerinde istenen bir konuma manuel olarak hareket ettirin. Probu çözelti içinde kaydırın, prob ile numunenin yüzeyi arasında bir ila iki milimetre bırakmaya dikkat edin.
Probun çözeltide dengelenmesi için beş dakika bekleyin. Optik mikroskopla proba odaklanın. Young'ın yumuşak malzeme modülünü ölçmek için, Deneyi Yapılandır'a tıklayın.
Daha sonra otomatik matris taraması için kullanılacak deneysel parametreleri belirlemek üzere yer değiştirme kontrolüne bir Yüzeyi Bul adımı ve tek bir girinti ekleyin. Tek girinti başarılı olursa, 10 ila 100 mikrometrede aralıklı 50 ila 100 nokta içeren bir matris taraması yapılandırın. Yüzeyi Otomatik Bul kutusunun işaretli olduğundan emin olduktan sonra, matris taramasını geçerli sahne alanı konumundan başlatmak için Sahne Alanı Konumunu Kullan'a tıklayın.
Yer değiştirme kontrolünde matris tarama profilini ayarlayın. Segment sayısını beşte bırakın ve varsayılan yer değiştirme profilini kullanın. Gerekirse, eğimli her segment için yer değiştirme profilini ve süresini değiştirin.
Saniyede 10 mikrometreden daha yüksek gerinim oranlarını aşmayın. Yapılandırılan denemeyi istenen deneme yoluna kaydedin. Denemeyi Çalıştır'a tıklayın ve tamamlanmasını bekleyin.
Tüm veriler alındığında, probu temizleyin ve cihazda açıklandığı gibi cihazı kapatın. Kuvvet-yer değiştirme eğrilerinin taranması ve temizlenmiş veri setinin JSON formatında üretilmesi için lansman hazırlığı. py, laboratuvar bilgisayarındaki komut satırından.
Açılır listeden Optics11 veri formatını seçin. Veriler doğru yüklenmezse, grafik kullanıcı arabirimini yeniden başlatın ve Optics11 Eski'yi seçin. Ardından, Klasörü Yükle'ye tıklayın ve analiz edilecek verileri içeren bir klasör seçin.
Grafik kullanıcı arabiriminin sağında bulunan sekmeleri kullanarak veri kümesini temizleyin. Ardından, JSON'u Kaydet'e tıklayın ve temizlenen veri kümesi için uygun bir ad girin. JSON dosyasını, geçerli bilgisayardan farklıysa, NanoAnalysis yazılımının yüklü olduğu bilgisayara gönderin.
Nano'yu başlatın. py dosyası komut satırından. Grafik kullanıcı arabiriminin sol üst köşesinde, Denemeyi Yükle'ye tıklayın ve JSON dosyasını seçin.
Bu, dosya listesini ve veri kümesini kuvvet-yer değiştirme eğrileri açısından gösteren ham eğriler grafiğini doldurur. İstatistikler kutusunda, üç parametrenin değerlerini işaretleyin: N etkin, N başarısız ve N hariç. Belirli bir eğriyi daha ayrıntılı olarak görselleştirmek için eğriye tıklayın.
Bu, yeşil renkte vurgulayacak ve geçerli eğri grafiğinde gösterecektir. Tek bir eğri seçildikten sonra, İstatistikler kutusunda R ve k parametreleri doldurulur. Veri kümesi daha fazla temizlendikten sonra, Filtreleme kutusunda uygulanan filtreleri kullanarak eğrilerdeki gürültüyü filtreleyin.
Ardından, geçerli eğri grafiğindeki filtrelenmiş eğrileri inceleyin. Filtrelenmiş eğri siyah, filtrelenmemiş versiyon ise yeşildir. Temas noktasını bulmak için, İletişim Noktası kutusundan, yazılımda uygulanmış olan bir dizi sayısal yordamdan birini seçin.
Algoritmanın parametrelerini, makalede açıklandığı gibi, temas noktasının doğru bir şekilde yerleştirilmesi için veri kümesine uyacak şekilde ayarlayın. Temas noktasının tek bir eğride nerede bulunduğunu görmek için, üzerine tıklayarak eğriyi seçin. Ardından, İncele'yi tıklatın.
İletişim noktasının nerede bulunduğunu belirlemek için görünen açılır pencereyi kontrol edin. Ardından, Hertz Analizi'ne tıklayın. Bu, üç grafik oluşturacaktır.
Veri kümesindeki her eğri için kuvvet girinti verilerini, kırmızı ile gösterilen ortalama Hertz uyumuyla birlikte kontrol edin. Ardından, bir standart sapma gösteren bir hata bandı ve kırmızı ile gösterilen ortalama Hertz uyumu ile birlikte ortalama kuvvet girinti eğrisini kontrol edin. Ardından, Young modülünün Hertz modelinin her bir eğriye uymasından kaynaklanan dağılım grafiğini kontrol edin.
Hesaplanan ortalama Young modülü ve standart sapması için Sonuçlar kutusunu inceleyin ve verilen deney için makul olduklarından emin olun. Ardından, Kaydet kutusunda, Hertz'e tıklayın. Açılır pencerede, dosya adını ve dizini girin ve Kaydet'e tıklayın.
Bir tsv dosyası oluşturulacaktır. İstatistiksel analiz ve daha fazla çizim için tsv dosyasını herhangi bir ek yazılımda açın. Hücre nanogirinti verileri için, Elastikiyet Spektrumu Analizi'ne tıklayın.
Üretilen iki grafiği, yani her eğri için girinti derinliğinin bir fonksiyonu olarak Young modülünü ve iki katmanlı bir modelin taktığı girinti fonksiyonu olarak ortalama Young modülünü inceleyin. Analiz tamamlandığında, Kaydet kutusundaki ES'ye tıklayın. Bu, belirtilen dizinde, tercih edilen başka herhangi bir yazılımda açılabilen ve çizilebilen bir tsv dosyasını dışa aktarır.
Başarılı bir deney, bir kuvvet yer değiştirme eğrisinin yaklaşım segmentinde, net, düz bir taban çizgisine, bir geçiş bölgesine ve eğimli bir bölgeye sahip olmasıyla sonuçlanır. Bu şekildeki değişiklikleri gösteren eğriler, NanoPrepare kullanılarak veri kümesinden kolayca kaldırılır. Yumuşak bir poliakrilamid hidrojel ve sert bir hidrojel için ortalama Hertz modeli ile birlikte ortalama kuvvet-girinti eğrileri burada gösterilmiştir.
Young modülünün bireysel değerleri çizilerek, her iki hidrojel için de beklenen ortalama Young modülü elde edildi. Hücre nanogirinti deneyleri için, ortalama kuvvet-girinti eğrisi ve buna karşılık gelen ortalama Hertz modeli, Hertz modelinin, hücre nanogirinti deneyleri için artan girinti derinliği ile kuvvetin evrimini tam olarak yakalamadığını göstermektedir. 200 nanometrelik bir girintiye kadar takılan ortalama elastikiyet spektrumları burada gösterilmiştir.
Ortalama elastikiyet spektrumları, 200 nanometrelik bir girinti derinliğinde artmaya başlar, bu da bir substratın sondalı görünür Young modülüne katkısını gösterir. Bu nedenle, hem Hertz hem de çift katmanlı model için uygun aralık olarak 200 nanometre seçildi. Çift katmanlı modelin takılması, ana metinde açıklandığı gibi, hücre aktin korteks kalınlığı, hücre aktin korteks modülü ve hücre yığın modülü de dahil olmak üzere hücrenin mekanik durumu hakkında daha fazla bilgi elde edilmesini sağlar.
Hertz modeli ile Young'ın modül dağılımı açısından elastikiyet spektrumu yaklaşımı arasındaki doğrudan bir karşılaştırma, elastisite spektrumu yaklaşımının fizibilitesini gösteren, karşılaştırılabilir araçlarla örtüşen dağılımları ortaya koymaktadır. Temas noktasını doğru bir şekilde konumlandırmak ve seçilen algoritma parametrelerini karşılaştırmak istediği veri kümeleri arasında tutarlı tutmak, numuneler arasında güvenilir karşılaştırmalar elde etmek için çok önemlidir. Yöntem, sferoidler, organoidler, dokular ve genel olarak tüm yumuşak maddeler dahil olmak üzere biyolojik örneklerin yerel elastik özelliklerini ölçmek için genel olarak uygulanabilirliktir.
