Bu makalede, M. Cyr bir lisans öğrencisi araştırma ödülü olarak G. Ebeveyn ve FRSQ için burslu olarak NSERC Hibe # 299.280, IRSST tarafından desteklenmiştir. Yoan Lemieux-Laneville video kaydedildi manipülasyonlar yapmak için teşekkür ederiz.

<html> Önceden herhangi bir manipülasyon, tendonların grup yapıyorlar deney ve cihazı kendi eğilim bağlı olarak kullanılmak üzere tanımlamanız gerekir. Bizim amaçlarımız için, ventral tendonları kesit alanı ölçüm ve biyoreaktör odasına takarken işlemek için böylece daha kolay çünkü daha küçük seçilen ve. Tüm aletler otoklava veya% 70 etanol ile sterilize olduğunu lütfen unutmayınız. Ayrıca,% 70 etanol içeren bir sprey şişesine her operasyon öncesi deneyciler eldiven sterilize etmek için her iş istasyonunun yanında yer alır. Bölüm 1: Ekstraksiyon Rezeksiyonu sonra, kuyruk dokulara zarar vermemek için dikkatle ekstremitelerde tarafından manipüle. Ayrıca, hücre canlılığını korumak için, tüm manipülasyonlar, soğuk tuzlu su solüsyonu içinde yapılır. 1A) Malzemeler: <ul><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> Ezilmiş buz </li><li> Yüzey koruyucu </li><li> Kesim tahta </li><li> Bireysel manipülasyon plakaları </li><li> 2 500 ml yemekleri </li><li> 2 2L cam yemekleri </li><li> Yapışkan bant </li><li> 1 Cımbız </li><li> 1 Forseps </li><li> 1 Cımbız standı </li><li> 1 Çift cerrahi makası </li><li> 1 Neşter </li><li> 1 Çift cerrahi makas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 yönelim kimlik ile bireysel manipülasyon (&quot;proksimal&quot; için &quot;P&quot;) </li></ul> 1B) İş istasyonu: <ol><li> Yüzey koruyucusu yaymak ve kesme tahtası üstüne yerleştirin. </li><li> , Kırılmış buz ile yarıya her iki büyük cam yemekleri doldurun ve kağıt üzerine koyun. </li><li> Manipülasyon plaka bir köşesine bir parça bant Stick ve proksimal sonunu belirtmek için bir harf ile tanımlamak. </li><li> Soğuk serum fizyolojik ile yarım ile iki küçük cam tabaklar ve manipülasyon plakaları tüm oluklar doldurun. Buz içeren geniş cam yemekleri yerleştirin. </li><li> Yüzey koruyucusu tüm steril aletleri düzenleyin. </li><li> Tuzlu solüsyon içeren cam tabak içine bir kuyruk aktarın. </li></ol> 1C) İşlemler: <ol><li> Dorsal tarafında ventral tarafı ayırt etmek için kuyruk proksimal sonunda anatomisi dikkat edin. Ventral tarafı tendonların daha çok sayıda ve küçük bir damla kan üretmek için kuyruk hafifçe sıkarak kontrol edilebilir bir kan damarı vardır. </li><li> Ventral tendon (veya dorsal tendonları gerekiyorsa ventral kenarı boyunca) ayıklamak istiyorsanız, cerrahi makas kullanarak, kuyruk dorsal kenarı boyunca deri kesme. </li><li> Proksimal sonunda kesi açın ve dikkatli bir şekilde kuyruk uçları manipüle ederek, forseps veya parmaklarınızı kullanarak cilt kaldırmak. </li><li> Salin solüsyonu kan ve saç durulayın ve taze solüsyon içeren kalan cam tabak içine örnek aktarmak. Eldivenleri değiştirin. Işık mikroskobu altında incelendi çapraz bölümünde altı tendon grupları gösterir. Her grup bir tendon Her omur kuyruk sonuna kadar bağlı, bu yüzden kesim boyunca yeni tendonları maruz intervertebral disk kesilir. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Enine bölümüne ışık mikroskobu altında incelendi sıçan kuyruğu. </li><li> Cerrahi makas ile kısa kıkırdak 2-3 vertebra ile distal ucu kesin. Kuyruk, neşter ve hemen ardından çözüm yerine kullanarak yumuşak dokuları kesmek için kesme tahtası üzerine yerleştirin. </li><li> Cımbız kullanarak, tek bir tendon distal kuyruk ucundan çekin. </li><li> Her iki ucunda yumuşak bir tutuş, bireysel manipülasyon plaka tendon yerleştirin. Daha fazla tendon dışarı alay kadar son iki adımı tekrarlayın ve yeni dokuların maruz gerektiğinde bir omur kısa kesmek. </li></ol> Bölüm 2: kesit alanı ölçüm 7 Doku mekanik karakterizasyonu veya stimülasyon uğrar, mekanik özellikleri tendon içinde stres kuvvet normalleştirilmesi tarafından açıklanmıştır. Bu kesit alanı değerlendirmek nedeni budur. 2A) Malzemeler: <ul><li> Optik Mikrometre </li><li> Stereomikroskopta </li><li> Dijital fotoğraf makinesi </li><li> Kenar tanıma ve bilgileri yeniden yapılanma algoritmaları 5,6 </li><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro hacmi pipet </li><li> Optik mikrometre ayarlamalar için 1 Hex anahtarı </li><li> 2 Cımbız / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 3 &quot;/&gt; Şekil 3 Optik Mikrometre </li></ul> 2B) İş istasyonu: <ol><li> Yazılım (Dijital kamera ve algoritmalar) açın. </li><li> Cihazın tendon yüklemek için yeterli bir oda var, böylece optik mikrometre yerleştirin. </li><li> Araçların ve elinizin altında çıkarılan tendonları içeren cam tabak düzenleyin. </li></ol> 2C) İşlemler: <ol><li> Her iki bağlantı sistemleri batık kadar soğuk tuzlu su çözeltisi ile ölçüm bölmesi doldurun. </li><li> Cımbız ile biter tutarak bölmeye tendon transferi. </li><li> Hacimli mikro-pipet ile emme kullanarak, bir defada bir silikon tüp içine ekstremite çekin. Aspire, sonuna mil yaka ötesine uzanan kadar. </li><li> Tüpler sıkıştırmak ve stereomicroscope altında cihazın yüklemek için mil yaka sıkın. </li><li> 105x büyütme kırışıklıklar artık algılanamadığı kadar doku gözlemlerken, tendonları germek. Ek% 0,40 gerin. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 105x büyütme önce ve sonra gerdirme Tendon projeksiyon. </li><li> Konumunu ayarlayın ve 180 ° döndürme üzerinde tendon net bir görüntü sağlamak için odak. </li><li> Gerginlik, odak veya pozisyon değiştirmeden 10 ° her devirde bir fotoğraf çekin. Sadece döner mil dönme yürütmek için kullanın. Konik şekli nedeniyle, bu adımlar, tendon boyunca farklı noktalarda tekrar edilebilir. </li><li> Kayıtlı olan veritabanı analiz etmek için kenar tanıma ve profil rekonstrüksiyon algoritmaları etkinleştirin. </li><li> Mil yaka gevşemesine ve mikro hacimli pipet kullanarak silikon tüpler içine hava üfleme tendon Bedava. </li><li> Tendon uçları yeniden işleme, manipülasyon plaka üzerine yeniden takın. </li><li> Elde edilen profil yeniden yapılanma ve kesit alanı değeri şekli olun. </li></ol> Bölüm 3: Durulama Önceki manipülasyonlar sırasında meydana gelmiş olabilir kirlenme kaldırmak için, dokuların biyogüvenlik kabini altında durulanır. 3A) Malzemeler: <ul><li> Soğuk salin solüsyonu (D-PBS) </li><li> Çoklu-groove manipülasyon plaka </li><li> Bireysel Manipülasyon plakaları </li><li> Yapışkan bant </li><li> 2 Cımbız </li><li> 1 Cımbız standı </li></ul> 3B) İş istasyonu: <ol><li> Önceden Biyogüvenlik kabini 15 dakika içinde fan açın ve% 70 etanol ile iç yüzeylerini temizlemek. </li><li> Biyogüvenlik kabini içindeki tüm enstrümanları getirin. </li><li> Proksimal sonuna belirlemek için, her bir plaka bir köşesine üzerine bant parçaları sopa. </li><li> Steril serum fizyolojik ile bütün oluklar doldurun. </li></ol> 3C) İşlemler: <ol><li> Ayıklanan kabinede tendon içeren manipülasyon plaka tanıtın. </li><li> Cımbız kullanarak, her iki ucunda hafif bir kavrayışa sahip, plaka tendon çıkarın. </li><li> Bırakın ve yavaşça en yakın ve en uzak oluk geçmeden, çoklu oluk manipülasyon plaka her bölmesi salin solüsyonu tendon karıştırın. </li><li> Son olarak, bireysel bir manipülasyon plakasını tendon daldırın. </li></ol> Bölüm 4: biyoreaktör odasına Yükleniyor Daha fazla kontaminasyonu önlemek için, aşağıdaki manipülasyonlar da biyogüvenlik kabini yapılmaktadır. 4A) Malzemeler: <ul><li> Biyoreaktör odasının 4 </li><li> Steril çapa </li><li> 1 Steril Petri kabı </li><li> Soğuk hücre kültürlerinde Orta (DMEM) </li><li> Siyanoakrilat </li><li> 2 Cımbız </li><li> Cımbız standı </li><li> 0.5-10μl Mikro hacimli pipet </li><li> 1 Cetvel <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Biyoreaktör kamara </li></ul> 4B) İş istasyonu: <ol><li> Bir önceki adımda da biyogüvenlik kabini, gerçekleştirilen bu yana gereksiz araçları kaldırılması daha fazla çalışma alanı verecektir. </li><li> Kabin içindeki tüm diğer araçlar getirin. </li></ol> 4C) İşlemler: <ol><li> Tendon ekstremite üzerinden merkezli ve doku yara, biriktirme ve makara çevresinde manipülasyon plaka üzerinde bir çapa yerleştirin. </li><li> Çapa Rulo ve doku çapa bağlı kalmasını sağlarken gevşek ekstremite tutun. Sonra ¾ dönüş durdurun. </li><li> Aynı yürütmekdiğer ucunu adımlar. </li><li> Kendi merkezlerinde 1 ila 6 cm kadar üzerinde hem çapa eşit döndürün. </li><li> Çözüm batırın ve bağlantılı bölümler, mekanik özelliklerini 2-3 geliştirmek için kısa bir süre kurumasını bekleyin tendon gevşetin. </li><li> Petri kabı içine siyanoakrilat dökün ve mikro ses pipet içine 2.5μL çizin. </li><li> Salin solüsyonu herhangi bir tutkal düşürmeden yara dokusu siyanoakrilat bir damla uygulayın. 2 damla her çapa kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Tendon hala tamamen dalmış, tamamen kurumasını tutkal için 5 dakika bekleyin. </li><li> Bu süre zarfında, tuzlu su çözeltisi ile oda bölmesi doldurun. </li><li> Tüm doku hasarı önlemek için serum fizyolojik ile rehidrate. </li><li> Biyoreaktör odasına sadece çapaların manipüle ederek, tendon transferi ve aktarım sırasında sızıntı ve kirlenmeyi önlemek için yakın. </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Protokol sonucu doğru yapıldığında, doku sıkı izolasyon ve hazırlık prosedürü doku kısırlık, canlılığı ve bütünlüğünü korumak için mümkün kılan gösterir. İlk olarak, basit ve tekrarlayan ekstraksiyon yöntemi kullanılarak ekstraksiyonu sonrası gerçekleştirilen H &amp; E kusurludur bölümden mikroskobik analizi ile görülebilir kollajen ağı zarar vermeden kuyruk tendon ayıklamak mümkün. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 ekstraksiyonu sonrası tendon kollajen ağı (H &amp; E ile boyanmış 5μm uzunlamasına kesit). Daha sonra kültür tendonları on gün yapılan sterilite testleri. Her gün, agar kaplama kullanılan kültür çözeltisi ve 24 saat süreyle inkübe. Herhangi bir bakteri üremesi gözlendi yana, bizim manipülasyonlar bulaşmaya sebep olmadığı sonucuna varmıştır. Profil rekonstrüksiyon algoritması ve optik mikrometre, biz hata 7% 2 marj içinde kesit alanı tahmin etmek mümkün. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7, bir RTT Profil rekonstrüksiyon . Son olarak, memeli hücreleri için durulama adım sonra, on iki günlük kültür süre sonra DEAD / CANLI Canlılık / Sitotoksisite Kit kullanarak canlılığı değerlendirildi. Yeşil flüoresan canlı hücreler büyük bir çoğunluğu belli olduğundan, izolasyon prosedürleri canlı doku koruyarak başarılı olduğunu teyit edebiliriz. Aynı test biyoreaktör odasına tendon taktıktan sonra iki saat yapıldı. Biz, çapa dehidratasyon ve yapıştırıcı her iki demir arasındaki doku yayılmış olduğu doğrulandı. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Şekil 8" /> Şekil 8 çapa Doku canlılığı (yeşil = canlı hücreleri, kırmızı = ölü hücreleri)

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

Bu deneysel yöntemler uygulanarak, biz bu tür dokuların geniş bir yelpazede in vitro çalışmalar yapabilirler. Örneğin, doku dejenerasyonu üzerine bir çalışma, on günlük bir süre için RTTs altında stimülasyon uygulama tarafından gerçekleştirildi. Her gün, tahribatsız stres gevşeme testleri doku mekanik özellikleri değerlendirildi. Sonunda, biz RTT stres değişimi gözlemlemek ve böylece mekanik özellikleri ilerlemesini analiz etmek mümkün. <img src="/fi...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Sıçan kuyruk tendon (RTTs) tendon fizyolojisi ve tendinopathy alanlarında in vitro çalışmalarda deneysel olarak kullanılan ortak bir biyolojik model. Bu dokuları ile çalışmak çok kırılgan olduğu için, zor ve şimdiye kadar kendi izolasyonu için herhangi bir titizlikle ayrıntılı bir protokol vardı. Bu zorlukları ile karşı karşıya kalan, biz RTTs manipülasyon ve kontrol doku canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü kolaylaştırmak için yöntemler ve araçlar geliştirdik. Bu makale, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için RTTs hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Ekstraksiyon, kesit alanı ölçümü, durulama ve biyoreaktör odasına yükleme: Çalışmalarımız dört ana adımları ayrılır. Her adımda, kolaylıkla çoğaltılabilir böylece tüm prosedürleri, malzeme ve manipülasyon detaylı olarak sunulmaktadır. Ayrıca, geliştirilen özel araçların sunulmuştur: RTTs ayırmak için kullanılan bir manipülasyon plaka, kesit alanı ölçüm ve ankraj sistemi sırasında doku konumlandırmak için bir optik mikrometre RTTs biyoreaktör üzerine takmak için. Son olarak, biz yöntemleri doğrulamak için birden fazla testlerinden sonra elde edilen sonuçlar açıklanmaktadır. Canlılığı, kısırlık ve bütünlüğünü değerlendirmeler prosedürleri gibi sıçan kuyruğu tendonları gibi hassas dokuların manipülasyonlar için yeterince titiz olduğunu göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies at JoVE.com

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Bu makalede, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için sıçan kuyruğu tendonları hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Biyoreaktör odasına durulama ve yükleme, çıkarma, kesit alanı ölçümü ile başlayan hazırlık olarak önemli adımlar çeşitli özellikleri göstermiştir.

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

preparation-rat-tail-tendons-for-biomechanical-mechanobiological

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Görüntüleme.  Université de Sherbrooke. Bu makalede, biyomekanik ve mechanobiological çalışmalar için sıçan kuyruğu tendonları hazırlamak için kullanılan deneysel prosedürleri açıklamaktadır. Biyoreaktör odasına durulama ve yükleme, çıkarma, kesit alanı ölçümü ile başlayan hazırlık olarak önemli adımlar çeşitli özellikleri göstermiştir.

Video: Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

Röportaj: Protein Katlama ve Nörodejeneratif Hastalıklar Çalışmaları

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

Biyoloji

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Nöron ve Glia Geliştirme Çalışmaları Rat Beyin Agrega Kültürler hazırlanması

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Mitokondri Yüksek Coupled Sıçan Kalp hazırlanması

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...