Biz bu iş ve Leicester Çekirdek Biyoteknoloji Hizmetleri Üniversitesi için kullanılan ifade yapıları hazırlamak için Dr Xiaowen Yang (PROTEX klonlama servisi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BBSRC öğrencilikle tarafından desteklenen, Wellcome Trust Programı ve Kıdemli Araştırmacı hibe WT085408 &amp; WT100237 ve BBSRC RM31G0224 hibe.

NOT: Protokol, bu nedenle reaktif hacimleri ve miktarları orantılı ölçekli gerektiğini ifade herhangi bir ölçek için uygundur. Uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada uygun bir klonlama (Şekil 1) ikinci sınırlama enzimleri seçimine bağlı olarak, bir afinite etiketi dahil veya hariç tutulması sağlayan değiştirilmiş pcDNA 3.1 sentezleme vektörünü kullandık. Aşağıdaki protokol, büyük ölçekli bir transfeksiyon açıklanmaktadır. 1 litrelik silindir şeklinde şişelerde geliştirilmiştir: 1. Büyük Ölçekli Kültür / transfeksiyonu Büyüme ve standart protokollere göre, süspansiyona adapte olmuş HEK293F hücreleri korumak. Tipik olarak 30 ila 100 ml &#39;lik başlangıç ​​kültürleri 250 ml konik bir hücre kültürü şişelerinde büyütülür. <ol><li> Her bir 1 litrelik silindir bir şişe içinde 300 ml lik bir son hacim için 0.5 x 10 6 hücre / ml tohum hücreleri. Not: Silindir şişe en fazla 150 ml &#39;lik bir minimum uyumSüspansiyon kültürünün 300 mi. Büyük ölçekli nakiller için birden fazla şişe kullanmayın. </li><li> Hücreler 1.0 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa ulaşana kadar 37 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı bir inkübatör içinde 24 saat 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin (hücreler yaklaşık olarak her 24 saatte bölmeliyiz). </li><li> Filtre ve sterilize edilen 300 ug DNA, toplam Pipet 3 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde 30 ml PBS ve girdap içine (tamamlayıcı şekli). Not: milyon başına transfekte edilmiş hücrelerin DNA 1 ug toplam kullanın. Iki ya da daha fazla plazmidin edilecek ise hücrelere DNA oranı sabit kalır, böylece her bir miktarını azaltmak birlikte-transfekte edilmiştir. </li><li> 1.2 ml 0.5 mg Ekle / 3 saniye boyunca kuvvetlice PBS / DNA çözümü ve vorteks PEI-süzülerek sterilize ml. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> DNA ekleme / PEI karışımı hücrelere - 1 x 10 6 hücre / ml (adım 1.3) de bir yoğunlukta olması gereken. </li><li> Müşterek transfeksiyon sonrasında hücreler inkübeBir başka 37 ° C de 48 saat, 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 boyunca orbital bir gece boyunca kuluçkaya yatırılmaktadırlar. </li><li> 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler -80 ° C&#39;de saklayın pelet Hasat hücre içi proteinlerdir. Not: Alternatif olarak, kültür ortamı üzerinde% 5 CO2 ile değiştirilir ve şişe kapağı kapatılır değilse (CO2), kuluçka makinesi çalkalanarak bir standart kullanır. Atmosfer her bir geçit (normal olarak her 2 gün) ile değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Tüm Hücre ekstresi 2. Protein saflaştırma kompleks Bu protokol, FLAG-etiketli proteinleri kullanılarak nükleer komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. <ol><li> Hücre topaklarını içine defrost ~ önceden soğutulmuş lizis tamponu, 40 ml (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100, proteaz inhibitörleri) kültür bir L başına. </li><li> Yeniden askıya pipetleme ve birkaç kez aşağı pelet (köpük önlemek vorteks yapmak değil). </li&gt; <li> İyice bir cam homojenleştirici kullanılarak hücrelerin yeniden askıya. 3 siklus (15 sn, 15 sn kapalı) için sonikasyon. 4ºC&#39;de 25 dakika boyunca 30.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant saklayın. </li><li> Dengeye reçine dengeleme tamponu (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5) ile üç kez yıkanarak kültürün her bir litresi için agaroz reçinesi paketlenmiş bir anti-flag 1.25 ml. </li><li> Bir ya da daha fazla 50 ml santrifüj tüplerine afinite reçinesiyle adım 2.3 bütün hücre ekstresi inkübe yavaşça 4 ° C&#39;de 30-120 dakika için örnek döndürün. </li><li> 4 ° C, ıskarta süpernatan 1 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Önceden soğutulmuş tampon 1 45 ml reçine ile yıkayın (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100). 1 dakika boyunca 3.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Adımı tekrar 2.7 tuz tamponu kullanılarak düşük tuzlu tampon (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7 ile (300 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5,% 5 gliserol), ardından0,5,% 5 gliserol) TEV yarılması tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM TCEP). NOT: Her yıkama emin olun tamamen artık reçine yeniden askıya ve yeterli kısa, yani olduğunu. </li><li> Reçine 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu (bağlı protein kontrol) 1 hacim içine sulandırmak. Reçineden antikoru serbest önlemek için indirgeyici maddeler kullanmayın. </li><li> Bir 15 ml santrifüj tüpüne önceden soğutulmuş TEV yarılma tamponu ve transfer 8-10 ml reçine yeniden askıya. </li><li> Ekle ~ 40 orijinal kültür bir L başına (1 mg / ml stok) TEV proteaz ug ve birçok kez aşağı ve yukarı pipetlenerek ile iyice karıştırın. </li><li> Protein oksidasyonunu önlemek için% 100 N 2 gazı ile tüp atmosferi değiştirin. </li><li> Yavaşça 4ºC&#39;de O / N döndürmek. </li><li> 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj. Uygun bir molekül ağırlığı kesmesi ile bir ultra santrifüj filtre içine süpernatant aktarın ve konsantre500 ul kadar. </li><li> Konsantre protein, 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu 1 hacim içine sulandırmak. (TEV kontrol sıyırma sıvısı). </li><li> Reçine, 10 ul numune toplayın ve analiz için 2x proteini yükleme tamponu içinde 1 hacim içine seyreltilir. Reçineden büyük miktarlarda antikor serbest önlemek amacıyla indirgeyici maddeler kullanmayın. (Post-TEV reçine kontrol). </li><li> Jel filtrasyon tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM TCEP) ile boyut dışlama kromatografisi kolonu dengelenmesi. </li><li> 0.22 um bir filtre ile filtre proteinini </li><li> Kolona numunenin yükleyin ve fraksiyonlarım toplamak. </li><li> Adım 2.9, 2.15 ve 2.16 ve analiz için bir SDS-PAGE ve Coomassie boyaması, adım 2.19 ikinci jel filtrasyon fraksiyonlardan çalıştırın örnekleri. Not: Bu, hedef proteininin ekspresyonunu doğrulamak için adımlar 2.9, 2.15 ve 2.16 önce jel süzülerek örnekler SDS-PAGE çalıştırmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold.">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li><li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+(ethylenimine)+and+its+role+in+gene+delivery.">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li><li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li><li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris.">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li><li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate.">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li><li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates.">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li><li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins.">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977 (2008).</li><li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells.">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li><li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK&#8208;293+Cells:+Application+to+Large&#8208;Scale+Protein+Production.">Transient Gene Expression in Suspension HEK&#8208;293 Cells: Application to Large&#8208;Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu ifade ile, rekombinant proteinleri ve memeli hücrelerinden çoklu bir alt birim kompleksinin saflaştırılması için büyük miktarda (PEI&#39;ler ticari olarak temin edilebilen lipofilik transfeksiyon reaktifleri daha az maliyeti), bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, son derece saf DNA (260/280 1.8 ila 2.0) PEI ile bir arada kullanıldığında, optimum transfeksiyon ve ekspresyon etkinliği ulaşılabilir. Hücreler serum- ve antibiyotik içermeyen ortam içinde kültür olmalıdır, bu nedenle sıkı bir şekilde steril teknik pahalı ve zaman alıcı enfeksiyonları önlemek için pasaj ve transfekte hücreler için gereklidir. Hücre canlılığı,% 90 ya da daha yüksek olmalıdır ve kültürler 2.5 x 10 6 hücre daha yüksek yoğunlukları ile olmamalıdır / hemen transfeksiyondan önce, bu sayede protein verimini düşürür ml. Başarılı transfeksiyon için, kültürler, sadece tek ya da bölünen hücreleri içermelidir. Kümeler gayretle tarafından kırılmış olabilir30 sn (Şekil 5) için lı vorteksleme 20. Ko-transfeksiyon kullanılan her plazmid oranı incelenmiştir olan kompleks bir karma bilgisine göre kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Bir kez uygun bir ekspresyon kurulabilir, böylece sentezlenmesi verimliliği, ilgilenilen protein için optimize edilebilir. Arıtma istenmeyen proteolitik bozulması riskini azaltmak için her zaman, protein numune soğuk tutmak yapılmalıdır. Genellikle daha düşük çözünürlük ve / veya enzimatik aktivite kaybı ile sonuçlanan, yapısal elemanlar veya belli proteinlerin aktif alanlarının müdahale edebilir yana etiketler ve saflaştırma tamponların seçimi kritiktir. Küçük ölçekli transfeksiyon, büyük protein komplekslerinin saflaştırılması için çeşitli konstruktlarının test edilmesi için özellikle yararlıdır. Bugün, farklı yöntem büyük bir çeşitlilik rekombinant proteinlerin ökariyotik (Tablo 2) ekspresyonu için kullanılabilir. Örneğin, Baculoviböcek hücrelerinde sentezleme rus yaygın olarak yüksek transdüksiyon verimliliği ve diğer viral türler 6 ile karşılaştırıldığında sitotoksisite eksikliğine bağlı olarak kullanılır. Bununla birlikte, virüs verme süreci, zaman alıcıdır ve istikrarsızlık virüs uzun süre saklanmasına izin vermez. Öte yandan, maya ekspresyon sistemleri, yüksek protein verimi 7 sonuçlanan fermentasyon kültürlerde hücre çok yüksek yoğunluklar büyüme ihtimalini sunmaktadır. Ama yine de doğru katlanmayacak ve protein partnerleri ile etkileşim için gereken ökariyotik proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar tam çeşitli yoksundur. HDAC3, örneğin, eksprese edilir, fakat E&#39;de bükülmemesini coli. 293F hücrelerinde ifade Ancak, onun ortak bastıncısı (SMRT) ve prokaryotik hücrelerde bulunmayan inositol tetrafosfat (IP4) 8, bir molekül ile kompleks aktif enzimin saflaştırılması mümkün. Bu yöntem ayrıca st arındırmak ve kristal çözmek için bize izin verdiHDAC1 üzerindeki etkisi benzer şekilde 9 IP4 aktive edilir nurd kompleksinde mta1 etkileşim kezlerinin. İdeal olarak, biz her zaman onların doğal, fizyolojik bir ortamda ökaryotik proteinleri ifade etmek istiyorum. Biyoreaktörler 10-12, HEK 293, EBNA1-hücreleri kullanan memeli ekspresyon sistemleri de tarif edilen ve proteininin çok yüksek seviyelerini elde edilmiştir, fakat bu kullanımı da karmaşıktır olabilir edilmiştir. Önerilen yöntem, bakteri, maya ve biyoreaktör sistemlerinde tanımlanması için basit ve erişilebilir bir alternatiftir. Ekspresyon yöntem hızlıdır ve silindir şişe, kavanoz bir atmosfer,% 5 CO2 ve standart çalkalanarak kuluçka kullanılan ile değiştirilir, özellikle pahalı ekipman kullanımını gerektirmez. Birden fazla plazmidler ortak transfeksiyonu ve kültürü içinde&gt; 1 mg / L&#39;lik bir verimle en fazla beş proteinlerle de kompleksler saflaştırmak için aşağıdaki protokol kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, sistem kararlı uslu komplekslerinin tanımlanmasını sağlar. Örneğin, exHDAC1 ve Sin3A ikili kompleksinin sıkıştırma protein sınırlı verimlerini verdi, ancak SDS3 ilavesi daha yüksek miktarlarda 5-kat ve bu nedenle uygun yapılar ve kristalize edilmesine yönelik olarak kararlı kompleksler seçimi yapısal biyologdan kılavuzları ile sonuçlanmıştır.

Moleküler hücre biyolojisi hızlı ilerleme ve tıp geliştirilmiş ilaçların sürekli bir ihtiyaç yapısal biyologlar giderek daha karmaşık protein yapılarının bakmak için bir ihtiyaç yarattı. Bu genellikle karmaşık bir katlama ve enzimatik aktivitesini desteklemek için özel bir post-translasyonel modifikasyonlar, moleküler şaperonlar ve ko-faktörlerini de gerektirebilir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri kullanılarak elde edilmiştir Protein Data Bank mevcut yapıların büyük çoğunluğu iken, prokaryotes bu değişiklikler çok sayıda yapamazsanız ve birçok temel ökaryot ko-faktörler yoksundur. Bu küçük sinyal molekülleri tarafından yanı sıra nükleer, hücre yüzeyinde ve ayrıntılı katlama makineleri gerektiren salgılanan proteinler aktive edilmiş büyük çok-alt birim komplekslerinin çalışma için bir sorun olabilir. E. bir dizi coli suşları bu sınırlamaların 1 bazılarının üstesinden gelmek için tasarlanmış edilmiştir. M Son yıllarda, ancak, kullanımonlar güvenilir diğer sistemlerde 2 ifade aksi takdirde sorunlu ökaryotik proteinler üretmek çünkü ammalian ifade sistemleri artmaktadır. Bugün kimyasal aracılığında transfeksiyon, viral transdüksiyon arasında değişen çeşitli teknikler vasıtasıyla kararlı ve geçici memeli ifadesi hücre çizgileri elde etmek mümkündür, örneğin elektroporasyon, doğrudan enjeksiyon 3 fiziksel gen transferi. Bu yöntemlerin hepsi avantaj ve dezavantajları kendi seti var ise, bunlardan sadece birkaç ya da çok pahalı ve / veya zaman alıcı olmak yapısal çalışmalar için uygundur. Burada askı büyümüş memeli hücrelerinde yapısal biyoloji, protein kompleksleri ifade etmek için, çok basit, hızlı, ucuz ama son derece etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım (örneğin, 293F Serbest HEK hücreleri) bir insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hattının geçici ko-transfeksiyon kullanır. Bu hücreler, HEK 293 mesaf elde edilmiştirII hattı, serumsuz ortam kullanılarak yüksek yoğunluğa (örneğin 293 Antarctica sentezlenmesi ortamı) ulaşan, süspansiyon kültürleri içinde büyümeye adapte edilir. Hücreler, bundan sonra, geçici polietilenimin dallı bir versiyonu (PEI), endositoz 5 konak hücre içine girer, DNA / PEI kompleksleri oluşturarak memeli hücrelerinin 4 arasında geniş bir aralıkta çalışması için rapor edilmiş bir ucuz polimerik bir reaktif kullanılarak transfekte edilir. Bu yöntem büyük ölçekte (30 mi) ve (300 ml kadar) büyük ölçekli deneyler için uygundur ve saflaştırılmıştır protein komplekslerinin yüksek seviyelerde üretebilir. Bu kompleks bir katlama makineleri, ko-faktörler ya da bakteri, maya ve böcek hücreleri tarafından yapılamaz, özellikle post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren protein çalışmaları için yararlıdır. Bu protokolde Sin3A transkripsiyonel represyon kompleksinden üç proteinin merkezi skafoldun ifadesi ve saflaştırılması sunuyoruz. Bu histon oluşmaktadırDeacetylase 1 (HDAC1), Arızalı suskunluğu 3 (SDS3) arasında Supresor ve Switch-bağımsız 3 (Sin3A). Arıtılmış karmaşık ve yüksek verimlilik kristallendirme çalışmalarında kullanılmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Burada HDAC1, SDS3, Sin3A üçlü kompleksin bir 2 L (8 x 250 mi kültür) geçici ko-transfeksiyon ve saflaştırılmasını göstermektedir. HDAC1 üzerindeki etkisi ve SDS3 Sin3A bir HDAC-etkileşim alanı (HID) aracılığıyla Sin3A etkileşime girer. Kültürün litresi başına kompleksi 1 mg a kadar bir tipik saflaştırma ürünleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil değiştirilmiş pcDNA 3.1 ekspresyon vektörünün şematik 1.. Plazmid Sin3A amino terminusunda afinite etiketi TEV yarılma sitesini içermeli EcoRV ve EcoRI ile sindirildi. HDAC1 ve SDS3 arasında etiketlenmemiş sürümlerini klonlanması amacıyla, vektör Kpnl ve EcoRI ile sindirildi. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. SDS-PAGE saflaştırma birinci aşamasını gösteren. &quot;Bağlı protein,&quot; şerit afiniteli bir reçine bağlı kompleksini göstermektedir. Sindirme işlemini takiben, TEV, Sin3A-HID üzerinde etiketi mevcut keislir ve jelin ikinci ve üçüncü şerit gösterildiği gibi karmaşık reçineden elüe edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil protein kompleksi kullanılarak saflaştınldı boyut dışlama kromatografisi 3. kromatogramı. Bu çözelti içinde bir dimer oluşturur, çünkü saf kompleks boşluk hacminde elüt unutmayın. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 3&#39;te gösterilen jel filtrasyon fraksiyonların gösteren Şekil 4, SDS-PAGE. 6 hücre / mL Ready 2.3x10 Şekil 5&#39;de Tripan mavi boyalı HEK 293F transfekte edilebilecek hücreler. Büyük kümeler, yaklaşık 25 saniye boyunca kuvvetli bir girdap tarafından kırılmış olabilir iken, sadece hücreler, tek veya bölünen hücreler olarak mevcut olması gerekmektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası nedenleri </td><td> Eylem </td></tr><tr><td rowspan="4"> Düşük protein verimi. </td><td> Düşük sayıda hücrelerin transfekte edildi. </td><td> Emin hücre yoğunluğu 1.0 x 10 6 kültüre transfeksiyon reaksiyon karışımının eklemeden önce yaklaşık olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td> Hücreler çok kez pasajlandı olabilir. </td><td> Yaklaşık 90 geçişten sonra Taze stok hücrelerini kullanınyaşları. </td></tr><tr><td> DNA, düşmüş ya da yabancı maddeler, yüksek bir miktarda olabilir. </td><td> Emin plazmid DNA, kullanılmakta olan 1.8 ve 2.0 arasında bir 260/280 oranına sahiptir. Bir agaroz jeli üzerinde çalışan DNA kalitesini değerlendirmek için tavsiye edilir. </td></tr><tr><td> Protein (ler) olarak ifade edilen sabit ya da yeterince çözünür değildir. </td><td> Önce transfections ölçekleme yukarı-küçük ölçekli Farklı yapıları test edin. Emin etiketler ilgilenilen protein (ler) in yapısı ile karışmaz olun. </td></tr><tr><td> Hücreler bulutlu bakmak ve sıradışı renk ve / veya koku var. </td><td> Hücreler, bakteri ya da maya ile enfekte edilir. </td><td> İyi steril teknik her zaman için kullanılmalıdır. Laminer akış davlumbaz buharla dezenfekte eden ve enfeksiyon durumunda, hücre kültür odası UV dezenfekte sorunu içeren yardımcı olur. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücreler, düşük canlılığı sahiptir. </td><td> Medyada yanlış pH. </td><td> Emin kültürler CO 2% 5-8 yetiştirilen emin olunher zaman. </td></tr><tr><td> Hücreler 3.0x10 6 hücre / ml &#39;den fazla bir yoğunluğa kadar kültürlenmiştir. </td><td> Hücreler, 2.5 x 10 6 hücre / ml hemen önce transfeksiyon ve asla 6 10 x 3,0 Yukarıda sözü edilen hücreler / ml üzerinde yoğunluklara büyümüş olmamalıdır. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Afinite saflaştırma işe yaramadı </td><td> Protein (ler) olarak ifade varlık değildir. </td><td> Yukarıdaki bakın. </td></tr><tr><td> Arıtma koşulları yanlış olabilir. </td><td> (Örneğin, yüksek tuz, düşük tuz, pH). Tampon koşullarını ayarlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sorun Giderme. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistem </td><td> Avantajları </td><td> Dezavantajları </td></tr><tr><td> E.coli </td><td><ul><li> Hızlıifade sistemi </li><li> Yüksek protein verimi </li><li> Ucuz </li><li> Izotopik olarak etiketlenmiş proteinlerin uygun üretimi için uygun </li></ul></td><td><ul><li> Protein katlanması için gerekli olabilir önemli şaperonlar eksikliği </li><li> Birçok post-translasyonel modifikasyonlar eksikliği </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Translasyon sonrası modifikasyonlar çoğunluğu gerçekleştirebilir miyim </li><li> Ucuz </li></ul></td><td><ul><li> Bazı çeviri-sonrası tadilat Lack </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Böcek hücrelerinde baculovirüs tanım </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilirsiniz &lt;/ Li&gt; <li> Bakulovirüs diğer viral suşlar daha az sitotoksik olan </li></ul></td><td><ul><li> Transdüksiyon virüsü hazırlanması zaman alıcıdır </li><li> Virüs kararlı değildir ve uzun süreler boyunca saklanamaz </li><li> Böcek hücreleri, protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Memeli sistemleri Biyoreaktörler </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Çok yüksek yoğunluklarda Can Hücre kültürü </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Çok yüksek protein verimi </li></ul></td><td><ul><li> Biyoreaktörü kullanmak için uzman personel gerektirir. </li><li> Pahalı ekipman gerekmektedir. </li><li> Optimize ifade koşuls zaman alıcı olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK hücreleri süspansiyon 293F </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Hızlı ve sezgisel transfeksiyon protokolü </li><li> Biyoreaktörler ve / veya diğer ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karşılaştırıldığında nispeten pahalı olmayan bir. </li></ul></td><td><ul><li> Bakterilerde ifadesi olarak olsa da uygun fiyatlı, ucuz değil </li></ul></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Avantajları ve ana sentezleme sistemlerinin dezavantajları.

Watch this Scientific Journal Video about Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach at JoVE.com

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

53.3K Görüntüleme.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Video: Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...