Bu yöntem, zebra balığı kalbindeki hedef proteinlerin ekspresyonunun doğru ve kolay bir şekilde tespit edilmesi için kullanılabilir. Hedef proteindeki değişim immünofluoresans ölçümü ile doğrudan tespit edilir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi zebra balığı embriyo toplama ve tedavi gerçekleştirin.
Döllenmeden 72 saat sonra embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin. Malformasyon oranlarını hesaplayın ve tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin ve ardından Türkiye'nin çoklu karşılaştırma testi.
Embriyoları mililitre MS222 başına 0,6 miligram ile uyuşturuyorktan sonra, 30 saniye boyunca kalp atışlarını kaydedin ve Image J yazılımını kullanarak kalp atışlarını ölçün. Stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesi ile zebra balığı embriyolarından kalpleri dikkatlice inceleyin. Temiz bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 pbs mikrolitresine% 4 paraformaldehitin 50 mikrolitresini ekleyin, ardından üç parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az beş dakika kurutun. Slaytları PBST'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
%5 BSA çözeltisi elde etmek için 1.000 mikrolitre PBST'ye 50 mikrolitre BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 8-hidroksideoksiguanosin'e karşı iki mikrolitre fare monoklonal antikorunu ve 296 pbst mikrolitresinde gama-H2AX'a karşı iki mikrolitre tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.
Kalp örneklerini, oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil antikor kokteyl çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 500 pbst mikrolitresinde fitc etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunun bir mikrolitresini ve bir mikrolitre psy-3 keçi anti-tavşan ikincil antikorun seyreltin.
Örnekleri sekonder antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Nükleer boyama için numunelere 20 mikrolitre DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Slayda bir kapak kayması uygulayın ve kurumasını ve hareketi önlemek için oje ile kapatın. Örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO denetim örneklerinin ortalamasını kullanarak göreli değişiklikleri hesaplayın ve verilerin istatistiksel önemini belirleyin.
Antioksidan, N-asetil-L-sistein veya NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM 2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi. PM 2.5'ten EOM, DMSO kontrolü ile tedavi edilen kalplere kıyasla perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kardiyak teratogenezde önemli bir artışa mal oldu. EOM'ye maruz kalan embriyolarda da kalp atış hızı önemli ölçüde azaldı.
NAC zayıflatılmış EOM kaynaklı kalp kusurlarının eklenmesi. EOM ile tedavi edilen dokularda DNA hasarının boyutunu değerlendirmek için immünoresans testi kullanıldı. EOM ile tedavi edilen zebra balığı embriyolarının kalplerinde 8-hidroksideoksiguanosin ve gama-H2AX ekspresyozin düzeyleri önemli ölçüde artmış, bu da sırasıyla oksidatif DNA hasarında ve DNA çift iplikçik kırılmalarında artış olduğunu gösterir.
EOM kaynaklı DNA hasarı NAC takviyesi ile kısmen etkisiz hale bırakıldı. Bu protokolü denerken, örnekleri PBS ile yıkarken dikkatli olun, çünkü zebra balığı kalbi slayttan soyulabilir.
