Bu prosedürün genel amacı, Parkinson hastalığının temel yönlerinin çoğunu bir hayvan modelinde yeniden üretmektir. Substantia nigra'da insan sinükleinini kodlayan adeno ilişkili viral vektörlerin stereotaksik verilmesi. Parkinson hastalığı, dopaminerjik nöronun nigrostriatal yolakta ölümünü ve sonuç olarak gönüllü hareketin kontrol kaybının ilerlemesini içeren nörodejeneratif bir hastalıktır.
Bu nörodejeneratif süreç, esas olarak sinüklein tarafından oluşturulan beyinde protein agrega birikimi ile eşlik eder. Ortaya çıkan kanıtlar, sinüklein agregalarının mikroglia üzerindeki toll benzeri reseptörleri uyarabileceğini ve böylece substantia nigra'da nöral inflamasyonu tetikleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, kanıtlar sinüklein agregalarının, antijen sunan hücreler tarafından T hücrelerine yakalanabileceğini ve sunulabileceğini ve sinükleine özgü adaptif bir bağışıklık tepkisini indükleyebileceğini göstermektedir.
Substantia nigra'daki insan sinükleinini kodlayan adeno ilişkili viral vektörlerin stereotaksik olarak verilmesi, sinüklein patolojisi, mikroglial aktivasyon, T-hücresi aktivasyonu, nörodejenerasyon ve motor bozukluk dahil olmak üzere hastalığın birçok temel yönünü yeniden ürettiğini göstermiştir. Bu çalışma, viral bir vektörün ve viral vektör dağıtımından sonraki zamanın, nigrostriatal yolaktaki insan sinüklein ekspresyonu, nörodejenerasyon ve nöroinflamasyon üzerindeki kapsamı ve ayrıca substantia nigra'da insan sinükleininin tek taraflı stereotaksik dağıtımının bir fare modelinde motor bozulma derecesini nasıl etkilediğinin bir analizini sunmaktadır. Aseptik bir ortam sağlamak için, tüm ameliyat sırasında ayakkabı kapakları, ameliyat maskesi, sıhhi bariyer, eldivenler ve ameliyat başlığı dahil olmak üzere uygun cerrahi kıyafetler giyin.
Aseptik ortamı korumak için fareye ve tüm cerrahi malzemelere etanol püskürtün. Bir analjezi indüklemek için, her 12 saatte bir, ameliyattan bir saat önce başlayarak ve ameliyattan üç gün sonrasına kadar devam ederek deri altından karprofen enjekte edin. Fareyi anestezik etmek için, hayvanı bir indüksiyon odasına yerleştirin.
İzofluran akışını% 0.5 oranında açın ve ardından fare sağ refleksini kaybedene kadar yaklaşık beş dakika içinde yavaşça% 5'e kadar artırın. Hayvanı indüksiyon odasından çıkarın. Hayvanı derhal uygun büyüklükte bir burun konisi ile solunum yapmayan bir devreye aktarın.
Fare anestezisini, ameliyat süresi boyunca% 1 izofluran ile koruyun. Farenin kuyruklarını ve pençelerini sıkıştırarak tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın. Kuyruğu ve pençeleri sıkıştırırken fare tepki vermediğinde, farenin tamamen anestezi uygulandığı anlamına gelir.
Fare kafasını makas kullanarak tıraş edin. Fare derisini% 2 klorheksidin içeren bir pamuklu çubukla temizleyin ve tüm saçları çıkarın. Fare kafasını stereotaksik çerçeveye sabitleyin.
Pamuklu çubukla her iki fare gözüne de kornea koruyucusu yerleştirin. Diğer kemirgenlerde stres indüksiyonunu önlemek için, ameliyathanede başka bir farenin varlığından kaçının. Fare kafasını üç tur klorheksidin 2% ve ardından etanol% 70 ile temizleyin Kafatasını cerrahi malzeme kullanarak ortaya çıkarın ve medial çizgiye göre anteroposterior 2.8 mm ve mediolateral 1.4 mm koordinatlarında bir matkapla ince bir delik açın.
10 mikrolitrelik bir şırınganın iğnesini deliğe koyun ve dura'ya göre 7.2 mm dorsoventral'e gelene kadar iğneyi beynin içinde yavaşça hareket ettirin. Dokunun biraz yerleşmesine izin vermek için iğneyi iki dakika boyunca son pozisyonda bırakın ve ardından her 30 saniyede bir 0.2 mikrolitre oranında sağ substantia nigra'ya bir mikrolitre viral vektör enjekte edin. İğneyi viral vektörlerin verilmesinden sonra beş dakika boyunca aynı pozisyonda bırakın ve ardından yavaşça geri çekin.
Steril bir ipek dikiş kullanarak yarayı kapatın. Fareyi elektrikli sıcak bir yatağın üzerine yerleştirerek önceden ısıtılmış ev kafesine koyun. Stereotaksik cerrahiden 12 hafta sonra, daha önce tarif edilen ışın testinin basitleştirilmiş bir versiyonunu kullanarak motor performansını değerlendirin.
Bu amaçla, 25 cm uzunluğunda ve 3 cm genişliğinde yatay bir kiriş kullanın. Kiriş yüzeyi, bir santimetrelik karelere sahip metalik bir ızgara ile kaplanmalı ve kirişin bir santimetre yukarısına yükseltilmelidir. Izgara yüzey kirişini geçerken, bir uçtan ev kafesinin bulunduğu kirişin karşı ucuna doğru farenin bir videosunu yapın.
Motor performansının belirlenmesinden önce fareyi iki gün boyunca eğitin. İlk gün, fareyi ızgara olmadan ışının içinden beş kez geçmesi için eğitin. İkinci günde, fareyi beş kez ızgara varlığında kirişin içinden geçmesi için eğitin.
Üçüncü günde, motor performansını değerlendirin. Bunu yapmak için, videoları ağır çekim modunda izleyerek, sol pençeler veya sağ pençeler tarafından ayrı ayrı gerçekleştirilen hataların sayısını ölçün. Fareyi anestezik etmek için, intraperitoneal olarak ketamin ve ksilazin karışımı enjekte edin.
Fare tamamen anestezi altına alındıktan sonra, toraksı cerrahi malzeme ile açın ve kalbi açığa çıkarın. Daha sonra kalbin sol ventrikülüne düz bir uç iğnesi yerleştirin. İğneyi bir boruya bağlayarak, peristaltik bir pompa kullanarak dakikada 9,5 mililitre hızında 50 mililitre fosfat tampon salini perfüze edin.
Beyni makas ve cımbız kullanarak çıkarın ve daha sonra fosfat tampon salin içinde beş mililitre% 4 paraformaldehit içine daldırarak sabitleyin. Daha sonra, sabit beyni 48 saat boyunca 15 mililitre% 30 sakkaroz içine koyun. Daha sonra beyni dört mililitre kriyoproteksiyon çözeltisine koyun ve beyni 80 derecede kaydedin veya bir sonraki adımda hemen kullanın.
Striatal dilimler elde etmek için, beyni 1.34 mm'den başlayıp 0.26 mm'de bitirerek 40 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın. Her dilimi anteroposterior sırayı izleyerek iki mililitrelik bir kriyotüp içinde hasat edin. Striatumda immünohistokimyasal ve immünofloresan analizi yapmak için, çekirdeğin tüm rostrokaudal derecesini kapsayan, düzgün aralıklarla alınan beş koronal striatal bölüm seçin.
Nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarında viral vektörlerin doğru iletimini doğrulamak için, substantia nigra'da GFP'yi kodlayan vektörler enjekte edildi ve 12 hafta sonra, GFP floresansı ve tirozin hidroksilaz immünoreaktivitesi, substantia nigra ve striatumda immünofloresan ile analiz edildi. GFP ile ilişkili floresan, sadece ipsilateral bölgede bulunuyordu ve hem substantia nigra hem de striatumda tirozin hidroksilaz immünoreaktivitesi ile önemli bir kolokalizasyon gözlendi ve bu da nigrostriatal yolun dopaminerjik nöronlarında viral vektörlerin doğru verildiğini gösterdi. Vektörlerin dozunu test etmek, gerekli sinükleini kodlamak, nigral dopaminerjik nöronların nörodejenerasyonunu teşvik eden insan sinükleininin önemli bir aşırı ekspresyonunu indüklemek için, vektörlerin farklı dozları enjekte edildi.
Ve 12 hafta sonra, insan sinüklein immünoreaktivitesi ve tirozin hidroksilaz immünoreaktivitesinin derecesi nigrostriatal yolda test edildi. İnsan sinüklein immünoreaktivitesi belirgindi, tüm dozlar substantia nigra'da test edildi. Bununla birlikte, fare başına sadece 10 ila 10 viral genom alan fareler, striatumda belirgin insan sinüklein immünoreaktivitesi sunmuştur.
İnsan sinükleinini kodlayan vektörlerin faresi başına 10 ila 10 viral genom alan fareler, substantia nigra'da önemli miktarda dopaminerjik nöron kaybı gösterdi. GFP'yi kodlayan aynı dozda vektör alan fareler düşük derecede nöronal kayıp göstermesine rağmen, bu fareler, insan sinükleinini kodlayan vektörleri alan farelere kıyasla, önemli ölçüde daha düşük nörodejenerasyon derecesi göstermiştir. Işın testi kullanılarak, yalnızca bu farelerde, insan sinükleinini kodlayan vektörlerin faresi başına 10 ila 10 viral genom alarak, sağ ve sol pençeler tarafından yapılan hataların sayısını karşılaştırırken veya insan sinükleinini kodlayan vektörleri alan farelerin toplam hata sayısını karşılaştırırken, motor performansında önemli bir azalma tespit edildi. kontrol vektörünü alan farelerle.
İnsan sinüklein ekspresyonunun başlangıcını tanımlamak için, fareler fare başına 10 ila 10 viral genom, insan sinükleinini kodlayan vektörler veya sahte cerrahi ile tedavi edildi ve insan sinüklein ekspresyonunun kapsamı, stereotaksik cerrahiden sonraki iki ila beş hafta boyunca, haftada bir kez substantia nigra'da analiz edildi. Sonuçlar, insan sinüklein ekspresyonunun stereotaksik ameliyattan sonraki beşinci haftada belirginleşmeye başladığını göstermektedir. Mikroglial aktivasyonun zirvesini belirlemek için, yüksek Iba1 seviyelerini eksprese eden hücrelerin derecesi, ameliyattan sonraki 2-15. haftalarda farelerin striatumunda ölçüldü.
Sonuçlar, viral aşılamadan 15 hafta sonra, farelerin kontralateral tarafına kıyasla, ipsilateral tarafın mikroglial aktivasyonunda önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Önemli nigraya sızan düzenleyici T hücrelerinin sayısı, immünofloresan ile stereotaksik cerrahiden sonra farklı zaman noktalarında analiz edildi ve ardından konfokal mikroskopi gözlemi yapıldı. Substantia nigra'ya düzenleyici T hücresi infiltrasyonunun zirvesi, ameliyattan sonraki 11. haftada gözlendi.
Burada analiz edilen nörodejenerasyonun fare modeli, Parkinson hastalığının patofizyolojisinde anahtar yön katılımının sayılarını incelemek için yararlı bir modeli temsil etmektedir. Sinüklein patolojisi, mikroglial aktivasyon, periferik immün sistemin nöroinflamasyona tutulumu ve nörodejenerasyon mekanizmalarında rol oynayan tutulum mekanizmaları Nörodejenerasyon, nöroinflamasyon, T hücrelerinin infiltrasyonu ve motor bozukluğu indüklemek için insan sinükleinini kodlayan uygun bir adeno ilişkili viral vektör dozu, fare başına 10 ila 10 viral genomdur. Bu çalışma, stereotaksik cerrahiden beş hafta sonra, insan sinüklein ekspresyonunun zaten belirgin olduğu, ancak bu hayvan modelinde motor bozulmanın yokluğunda önemli bir zaman noktası oluşturduğunu göstermektedir.
Böylece, bu zaman noktası, nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonun ilerlemesini durdurmak için uyarlanmış deneysel tedavilerin uygulanmasına başlamak için ilginç bir zamansal noktayı temsil eder. Bu hayvan modelinde nöroinflamasyonu analiz etmek için en uygun zaman noktası, stereotaksik bir ameliyattan sonra 15. haftadır. Merkezi sinir sistemine T hücresi infiltrasyonunu analiz etmek için uygun bir zaman noktası iken.
viral vektör aşılamasından sonra 11. haftada görünüyor.
