Bugün göstereceğimiz yöntem, COVID-19 enfeksiyonları veya rutin analizler için aşılama ile ilişkili antikorların sero-dönüşümünü değerlendirmek için yüksek verimli bir çözüm sunmaktadır. İlginç bir şekilde, bu yaklaşım aynı analit üzerinde birden fazla epitopu değerlendirmemizi sağlar. Bunun, hücre sinyalizasyon çalışmaları ve bağışıklık tepkilerinin izlenmesi de dahil olmak üzere biyolojik bilimlerde çok sayıda uygulaması vardır.
Bugün sizin için bu tekniği gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr. Imad Tarhoni olacaktır. Başlamak için, benzersiz boncuk bölgelerine sahip manyetik mikrosferlerin üç farklı şişesini seçin ve kullanılan her şişe için boncuk kimliğini ve lot bilgilerini kaydedin. Ardından, seçilen mikrosfer stoğunu 60 saniye boyunca vorteksleyin ve beş dakika boyunca sonikleştirin.
1,5 mililitrelik düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne altı boncuğa 1,0 kat 10 aktarın ve tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin. 60 saniye boyunca ayırmaya izin vermek için. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın, ardından boncukları 100 mikrolitre HPLC sınıfı su ve vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın. Yine, tüpü 60 saniye boyunca manyetik ayırıcıya geri yerleştirin ve daha sonra süpernatanı çıkarın. Yıkama protokolünü iki kez tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikrosferleri 90 mikrolitre aktivasyon tamponunda, pH 6.2'de, vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın. Daha sonra, mikrosferleri sırasıyla 10 saniye boyunca vorteks ile mililitre başına 10 mikrolitre 50 miligram anhidroksi-sülfosüksinamid ve mililitre EDC çözeltisi başına 10 mikrolitre 50 miligram ile muamele edin. Daha sonra, mikrosferleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir yumuşak bir vorteks ile inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, mikrosferleri daha önce açıklandığı gibi 50 milimolar MES veya kaplin tamponu, pH 5.0 ile iki kez yıkayın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları vorteks tarafından 100 mikrolitre kaplin tamponu ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın, ardından derhal tüpe istenen miktarda protein ekleyin.
Kaplin tamponu ile toplam hacmi 150 mikrolitreye getirin ve reaksiyonu vorteks ile 30 saniye boyunca karıştırın. Daha sonra, tüpü oda sıcaklığında döndürerek iki saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, mikrosferleri PBS söndürme tamponu ile iki kez yıkayın ve yıkanmış mikrosferleri, vorteks tarafından% 0.05 sodyum azid içeren 100 mikrolitre söndürme tamponunda 30 saniye boyunca yeniden askıya alın.
Otomatik bir hücre sayacı kullanarak geri kazanılan mikrosferlerin sayısını sayın ve gözlemlenen boncuk konsantrasyonunu kaydedin. Tahlil performansı için, birleştirilmiş mikrosferleri vorteks ile 30 saniye boyunca yeniden askıya alın ve 60 ila 90 saniye boyunca sonikasyon yapın. Ardından, her bir boncuk kolloidinin gerekli miktarını ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
Ardından, tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmaya izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Boncukları ayırıcıdan çıkardıktan sonra, boncukları 100 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden askıya alın.
Boncukları ayırmak için tüpü 60 saniye boyunca manyetik bir ayırıcıya yerleştirmeden önce 30 saniye boyunca vorteks. Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, her hedef için bir mikrolitre başına 100 mikrosferlik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimli bir tahlil tamponu ekleyerek üç katlı çalışma mikrosfer karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.
Aliquot 25 mikrolitre mikrosfer karışımı 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna. Plazma veya serum örneklerini tahlil tamponunda 500 kat seyreltin ve istenen titrasyona göre standart numuneler hazırlayın. Boş numune olarak 25 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunelerin veya standardın her birini 96 kuyucuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir kuyucuğuna ekleyin.
Tamamlandığında, dakikada 700 dönüşe ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmek için plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün. Makalede açıklandığı gibi tahlil tamponu ile mikrolitre başına dört mikrogramda anti-insan tespit antikorları veya ikincil antikor çözeltilerinden oluşan bir çözelti hazırlayın. Hızlı bir şekilde yıkamak için plakayı manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve ardından sıvıyı kuyucuklardan çıkarmak için plakayı biyolojik tehlike kabının üzerine zorla ters çevirin.
Plaka hala ters çevrilmişken, plakayı kalın bir kağıda karşı zorla dokunun. Daha sonra, her bir kuyucuğu 100 mikrolitre tahlil tamponu ile yıkayın ve sıvıyı biyolojik tehlike kabı üzerinde zorla ters çevirerek çıkarın. Yıkamayı iki kez tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra, kullanılmış tüm kağıt parçalarını biyolojik tehlike kabına atın. Daha sonra, 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 mikrolitre ikincil antikor çalışma çözeltisi ekleyin ve dakikada 700 dönüşte bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe etmek için plakayı alüminyum folyo ile örtün. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, plakanın kuyucuklarını daha önce gösterildiği gibi tahlil tamponu ile iki kez yıkayın.
Ardından, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcı üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin. 60 mikrolitrelik bir numuneyi cihaz analizörü aracılığıyla sistem el kitabına göre analiz edin.
Numune yakalama inkübasyon süresinin optimizasyonu için, plakaları 30, 60 ve 120 dakikalık bir süre boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, analizör üzerindeki tahlil karışımının 60 mikrolitresini analiz edin. Spike S1, membran antikorları ve nükleokapsid için 1: 5 seri seyreltme serisine dayanan yedi noktalı standart bir eğri değerlendirildi.
Tahlil içi hassasiyet testi, varyasyon, standart sapma ve ortalama yüzdesi katsayısı olarak hesaplanan tahlil hassasiyetini değerlendirmek için plaka üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tahliller arası hassasiyet için, her tahlil için boncuk setlerinin üç ayrı partisi hazırlandı. Standart ve insan plazma örnekleri ile tahlilin hassasiyet değişkenleri hesaplandı.
İnkübasyonun 120 dakikasındaki ortalama medyan floresan yoğunluk değerleri, spike S1, membran ve nükleokapsid antikorları için IgG titreleri için en uygundu ve bu da hızlı bir primer antikor bağlayıcı kinetik olduğunu gösteriyordu. Çift kanallı performanstaki ikincil antikor konsantrasyonu optimizasyonları, tüm konsantrasyonlar için doğrusal ölçümlerde çok çeşitli sinyaller göstermiştir. İkincil antikorların farklı zaman inkübasyonlarından gözlemlenen sinyaller ve tüm inkübasyon süreleri için sinyal değişimleri hakkındaki detaylar burada gösterilmiştir.
Çift kanallı analizler için özgüllük değerlendirmelerinde, boşluk ve tek muhabir kanalı arasında ihmal edilebilir çapraz sinyal kontaminasyonu gözlenmiştir. COVID 19 aşılamasını takiben sero-dönüşüm olaylarının çiziminde, gözlenen ani S1 IgA ve IgM değerleri, IgG izotip titrelerinden yaklaşık 40 kat daha düşüktü. Bu yöntemin, bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde aşılara yanıtı izlemek için önemli etkileri vardır.
Bu hastaların bu aşılarla gerçekten korunup korunmadığını belirlememize izin verecektir.
