توفر الطريقة التي سنعرضها اليوم حلا عالي الإنتاجية لتقييم التحويل المصلي للأجسام المضادة المرتبطة إما بعدوى COVID-19 أو التطعيم للتحليلات الروتينية. ومن المثير للاهتمام أن هذا النهج يسمح لنا بتقييم ظواهر متعددة على نفس التحليل. هذا له العديد من التطبيقات في العلوم البيولوجية ، بما في ذلك دراسات إشارات الخلايا ومراقبة الاستجابات المناعية.
سيوضح لك اليوم هذه التقنية الدكتور عماد ترهوني، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. للبدء ، حدد ثلاث قوارير مختلفة من الميكروسفير المغناطيسي مع مناطق خرزة فريدة من نوعها وسجل معرف الخرزة ومعلومات الكثير لكل قارورة مستخدمة. ثم ، دوامة مخزون المجهر المحدد لمدة 60 ثانية وسونيكات لمدة خمس دقائق.
انقل 1.0 في 10 إلى الخرز الستة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض البروتين 1.5 ملليلتر وأدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي. للسماح بالفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant بعناية دون إزعاج حبيبات الخرزة.
قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي ، ثم أعد تعليق الخرز ب 100 ميكرولتر من الماء والدوامة من فئة HPLC لمدة 30 ثانية. مرة أخرى ، ضع الأنبوب مرة أخرى في الفاصل المغناطيسي لمدة 60 ثانية ثم قم بإزالة supernatant. كرر بروتوكول الغسيل مرتين.
بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط ، الرقم الهيدروجيني 6.2 ، بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، عالج الميكروسفير بالتتابع ب 10 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل ملليلتر من أنهيدروكسي سلفوسوكسيناميد و 10 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل محلول EDC ملليلتر بواسطة دوامة لمدة 10 ثوان. في وقت لاحق ، احتضن الميكروسفير لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع دوامة لطيفة كل 10 دقائق.
بعد الحضانة ، اغسل الميكروسفير مرتين باستخدام MES 50 مللي مولا أو المخزن المؤقت للاقتران ، الرقم الهيدروجيني 5.0 ، كما هو موضح سابقا. كرر الغسيل مرتين. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة الأنبوب من الفاصل المغناطيسي وأعد تعليق الخرز مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية ، تليها على الفور إضافة الكمية المطلوبة من البروتين إلى الأنبوب.
ارفع الحجم الإجمالي إلى 150 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للاقتران وامزج التفاعل بواسطة الدوامة لمدة 30 ثانية. ثم ، احتضن الأنبوب لمدة ساعتين عن طريق الدوران في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الميكروسفير مرتين باستخدام مخزن PBS العازل للإرواء وأعد تعليق الميكروسفير المغسول في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإرواء الذي يحتوي على 0.05٪ من أزيد الصوديوم بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية.
عد عدد الميكروسفير المسترد باستخدام عداد خلية آلي وسجل تركيز الخرز المرصود. للحصول على أداء الفحص ، أعد تعليق الميكروسفير المقترن بواسطة دوامة لمدة 30 ثانية وسونيكات لمدة 60 إلى 90 ثانية. ثم قم بإزالة الكمية المطلوبة من كل غرواني خرزة من الأنبوب المعني والجمع بين غرويات الخرز في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
بعد ذلك ، أدخل الأنبوب في فاصل مغناطيسي واسمح بالفصل لمدة 60 ثانية. مع بقاء الأنبوب في الفاصل المغناطيسي ، قم بإزالة supernatant دون إزعاج حبيبات الخرز. بعد إزالة الخرز من الفاصل ، أعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص.
دوامة لمدة 30 ثانية قبل وضع الأنبوب في فاصل مغناطيسي لمدة 60 ثانية لفصل الخرز. كرر الغسيل مرتين. بعد ذلك ، اضبط تركيز خليط المجهر العامل ثلاثي البلكس عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص لتوليد تركيز نهائي قدره 100 ميكروسفير لكل ميكرولتر واحد لكل هدف.
Aliquot 25 ميكرولتر من خليط المجهر في كل بئر من لوحة 96 بئر. تمييع عينات البلازما أو المصل 500 ضعف في المخزن المؤقت للفحص وإعداد العينات القياسية وفقا للمعايرة المطلوبة. أضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص كعينة فارغة وأضف كل عينة من العينات المخففة أو القياسية إلى كل بئر معين من لوحة عينة 96 بئرا.
عند الانتهاء، قم بتغطية اللوحة بختم أو رقائق معدنية من الألومنيوم لتحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر صفيحة مضبوط على 700 دورة في الدقيقة. قم بإعداد محلول من الأجسام المضادة للكشف عن الإنسان أو محاليل الأجسام المضادة الثانوية بمعدل أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر مع مخزن مؤقت للفحص كما هو موضح في المخطوطة. ضع الصفيحة على فاصل مغناطيسي لغسلها بسرعة ثم قم بعكس اللوحة بقوة فوق حاوية خطرة بيولوجيا لإزالة السائل من الآبار.
مع بقاء اللوحة مقلوبة ، اضغط بقوة على اللوحة مقابل واد سميك من الورق. ثم اغسل كل بئر ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص وقم بإزالة السائل عن طريق الانعكاس القوي فوق حاوية المخاطر البيولوجية. كرر الغسيل مرتين.
بعد الغسيل الأخير ، تخلص من جميع الوديان الورقية المستخدمة في حاوية للمخاطر البيولوجية. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا وقم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم لاحتضانها على شاكر صفيحة بمعدل 700 دورة في الدقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اغسل آبار الطبق مرتين باستخدام مخزن الفحص العازل كما هو موضح سابقا.
ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر من لوحة 96 بئرا. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضنيه لمدة خمس دقائق على شاكر الطبق في درجة حرارة الغرفة. قم بتحليل عينة سعة 60 ميكرولتر عبر محلل الأدوات وفقا لدليل النظام.
لتحسين وقت حضانة التقاط العينات ، احتضن الألواح لمدة 30 و 60 و 120 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتحليل 60 ميكرولتر من خليط الفحص على المحلل. تم تقييم منحنى قياسي من سبع نقاط يعتمد على سلسلة تخفيف تسلسلية 1: 5 ل spike S1 ، والأجسام المضادة للغشاء ، و nucleocapsid.
تم إجراء اختبار الدقة داخل الفحص على اللوحة لتقييم دقة المقايسة المحسوبة كمعامل النسبة المئوية للتباين والانحراف المعياري والمتوسط. من أجل دقة الفحص البيني ، تم إعداد ثلاث دفعات متميزة من مجموعات الخرز لكل فحص. تم حساب المتغيرات الدقيقة للفحص مع المعيار وعينات البلازما البشرية.
كان متوسط قيم كثافة الفلورسنت المتوسطة في 120 دقيقة من الحضانة مثاليا لعيار IgG للسبايك S1 والغشاء والأجسام المضادة للنيوكليوكابسيد ، مما يشير إلى حركية ربط الأجسام المضادة الأولية السريعة. أظهرت تحسينات تركيز الأجسام المضادة الثانوية في أداء القناة المزدوجة مجموعة واسعة من الإشارات في القياس الخطي لجميع التركيزات. يتم عرض الإشارات المرصودة من حضانات زمنية مختلفة للأجسام المضادة الثانوية والتفاصيل المتعلقة بتغيرات الإشارة لجميع أوقات الحضانة هنا.
وفي تقييمات خصوصية المقايسات ثنائية القناة، لوحظ تلوث ضئيل بالإشارات المتقاطعة بين القناة الفارغة وقناة المراسل الواحدة. في الرسم التوضيحي لأحداث التحويل المصلي بعد التطعيم ضد كوفيد 19، كانت قيم الارتفاع المرصودة S1 IgA و IgM أقل بنحو 40 ضعفا من عيارات النمط المتماثل IgG. هذه الطريقة لها آثار مهمة على رصد الاستجابة للقاحات لدى الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة.
سيسمح لنا بتحديد ما إذا كان هؤلاء المرضى يحصلون حقا على الحماية من تلك اللقاحات.
