O método que demonstraremos hoje fornece uma solução de alto rendimento para avaliar a conversão soro de anticorpos associados a infecções covid-19 ou vacinação para análises de rotina. Curiosamente, essa abordagem nos permite avaliar vários epítopos no mesmo analito. Isso tem inúmeras aplicações nas ciências biológicas, incluindo estudos de sinalização celular e monitoramento de respostas imunes.
Demonstrando esta técnica para vocês hoje será o Dr. Imad Tarhoni, um pós-doutorando no meu laboratório. Para começar, selecione três frascos diferentes das microesferas magnéticas com regiões de contas únicas e regis de contas únicas e regis de lote para cada frasco utilizado. Em seguida, o vórtice do estoque de microesfera selecionado por 60 segundos e sonicate por cinco minutos.
Transfira 1,0 vezes 10 para as seis contas para um tubo de microcentrifusidade de ligação de proteína de 1,5 mililitro e insira o tubo em um separador magnético. para permitir a separação por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova cuidadosamente o sobrenatante sem perturbar a pelota de contas.
Remova o tubo do separador magnético e, em seguida, resuspenja as contas com 100 microliters de água e vórtice de hplc por 30 segundos. Novamente, coloque o tubo de volta no separador magnético por 60 segundos e, posteriormente, remova o sobrenante. Repita o protocolo de lavagem duas vezes.
Após a última lavagem, remova o tubo do separador magnético e ressumem as microesferas lavadas em 90 microliters de tampão de ativação, pH 6.2, por vórtice por 30 segundos. Em seguida, trate sequencialmente as microesferas com 10 microlitadores de 50 mililígratos por mililitro anhydroxy-sulfosuccinamida e 10 microlitrais de 50 mililíquidos por solução EDC mililitro por vórtice por 10 segundos. Mais tarde, incubar as microesferas por 20 minutos em temperatura ambiente com um vórtice suave a cada 10 minutos.
Após a incubação, lave as microesferas duas vezes com MES de 50 mililitros ou tampão de acoplamento, pH 5.0, como descrito anteriormente. Repita a lavagem duas vezes. Uma vez feito, remova o tubo do separador magnético e resuspenja as contas com 100 microliters de tampão de acoplamento por vórtice por 30 segundos, seguido imediatamente adicionando a quantidade desejada de proteína ao tubo.
Leve o volume total para 150 microliters com tampão de acoplamento e misture a reação por vórtice por 30 segundos. Em seguida, incubar o tubo por duas horas por rotação à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as microesferas duas vezes com tampão de sarampo pbs e resuspenja as microesferas lavadas em 100 microliters de tampão de sada contendo azida de sódio de 0,05% por vórtice por 30 segundos.
Conte o número de microesferas recuperadas usando um contador celular automatizado e regise a concentração de contas observada. Para o desempenho do ensaio, resuspenja as microesferas acopladas por vórtice por 30 segundos e sonicar por 60 a 90 segundos. Em seguida, remova a quantidade necessária de cada coloide de contas do respectivo tubo e combine os coloides de contas em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, insira o tubo em um separador magnético e permita a separação por 60 segundos. Com o tubo ainda no separador magnético, remova o supernatante sem perturbar a pelota de contas. Depois de remover as contas do separador, resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de ensaio.
Vórtice por 30 segundos antes de colocar o tubo em um separador magnético por 60 segundos para separar as contas. Repita a lavagem duas vezes. Em seguida, ajuste a concentração da mistura de microesfera de trabalho de três plex adicionando um volume apropriado de tampão de ensaio para gerar uma concentração final de 100 microesferas por um microliter para cada alvo.
Alíquota 25 microlitadores da mistura de microesfera em cada poço de uma placa de 96 poços. Diluir amostras de plasma ou soro 500 vezes no tampão de ensaio e preparar amostras padrão de acordo com a titulação desejada. Adicione 25 microliters de tampão de ensaio como amostra em branco e adicione cada uma das amostras diluídas ou padrão em cada poço designado de uma placa de 96 poços.
Quando terminar, cubra a placa com uma vedação de alumínio ou folha para incubar por uma hora em temperatura ambiente em um agitador de placas definido para 700 rotações por minuto. Prepare uma solução de anticorpos de detecção anti-humana ou soluções secundárias de anticorpos em quatro microgramas por microliter com tampão de ensaios conforme descrito no manuscrito. Coloque a placa sobre um separador magnético para lavar rapidamente e, em seguida, inverta com força a placa sobre um recipiente de risco biológico para remover o líquido dos poços.
Com a placa ainda invertida, bata com força a placa contra um maço de papel grosso. Em seguida, lave cada poço com 100 microliters de tampão de ensaio e remova o líquido por inversão forçada sobre um recipiente de risco biológico. Repita a lavagem duas vezes.
Após a última lavagem, descarte todos os maços de papel usados em um recipiente de risco biológico. Em seguida, adicione 25 microliters de solução de trabalho de anticorpos secundários a cada poço de uma placa de 96 poços e cubra a placa com papel alumínio para incubar em um agitador de placa a 700 rotações por minuto. Após 30 minutos de incubação, lave os poços da placa duas vezes com tampão de ensaio como demonstrado anteriormente.
Em seguida, adicione 100 microliters de tampão de ensaio em cada poço da placa de 96 poços. Cubra a placa com papel alumínio e incubar por cinco minutos em um agitador de pratos à temperatura ambiente. Analise uma amostra de 60 microliter através do analisador de instrumentos de acordo com o manual do sistema.
Para otimização do tempo de incubação da captura da amostra, incubar as placas por uma duração de 30, 60 e 120 minutos. Após a incubação, analise 60 microliters da mistura de ensaio no analisador. Uma curva padrão de sete pontos baseada em uma série de diluição serial de 1:5 foi avaliada para o pico S1, os anticorpos de membrana e o nucleocapsídeo.
O teste de precisão intra-ensaio foi realizado na placa para avaliar a precisão do ensaio calculada como coeficiente percentual de variação, desvio padrão e média. Para precisão entre ensaios, três lotes distintos dos conjuntos de contas foram preparados para cada ensaio. Foram calculadas variáveis de precisão do ensaio com o padrão e as amostras de plasma humano.
Os valores médios de intensidade fluorescente em 120 minutos da incubação foram ideais para os títulos de IgG para o pico S1, a membrana e os anticorpos nucleocapsídeos, indicando uma cinética de ligação de anticorpos primários rápido. Otimizações secundárias de concentração de anticorpos no desempenho de canal duplo demonstraram uma ampla gama de sinais em medição linear para todas as concentrações. Os sinais observados de diferentes incubações de tempo dos anticorpos secundários e os detalhes sobre as alterações de sinal para todos os tempos de incubação são mostrados aqui.
Nas avaliações específicas para ensaios de dois canais, observou-se contaminação insignificante de sinal cruzado entre o vazio e o canal de repórteres único. Na ilustração dos eventos de conversão de soro após a vacinação COVID 19, os valores observados de pico S1 IgA e IgM foram aproximadamente 40 vezes menores que os títulos de isótipo IgG. Este método tem implicações importantes para monitorar a resposta às vacinas em indivíduos imunocomprometidos.
Isso nos permitirá determinar se esses pacientes estão realmente sendo protegidos por essas vacinas.
