Метод, который мы продемонстрируем сегодня, обеспечивает высокопроизводительное решение для оценки серопреобразования антител, связанных либо с инфекциями COVID-19, либо с вакцинацией для рутинных анализов. Интересно, что такой подход позволяет оценить несколько эпитопов на одном и том же анализируемом веществе. Это имеет многочисленные применения в биологических науках, включая исследования клеточной сигнализации и мониторинг иммунных реакций.
Продемонстрировать эту технику для вас сегодня будет доктор Имад Тархони, постдокторант в моей лаборатории. Для начала выберите три разных флакона магнитных микросфер с уникальными областями бусин и запишите идентификатор бусины и информацию о партии для каждого используемого флакона. Затем вихрьте выбранный запас микросферы в течение 60 секунд и обработайте ультразвуком в течение пяти минут.
Переложите 1,0 раза по 10 на шесть шариков в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с низким содержанием белка и вставьте трубку в магнитный сепаратор. , чтобы обеспечить разделение в течение 60 секунд. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулу шарика.
Извлеките трубку из магнитного сепаратора, затем повторно суспендируйте шарики 100 микролитрами воды класса ВЭЖХ и вихрем в течение 30 секунд. Опять же, поместите трубку обратно в магнитный сепаратор на 60 секунд и затем удалите супернатант. Повторите протокол стирки дважды.
После последней промывки извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте промытые микросферы в 90 микролитрах буфера активации, рН 6,2, вихрем в течение 30 секунд. Далее последовательно обрабатывают микросферы 10 микролитрами по 50 миллиграммов на миллилитр ангидроксисульфосукунамида и 10 микролитрами по 50 миллиграммов на миллилитр раствора EDC вихрем в течение 10 секунд. Позже насиживайте микросферы в течение 20 минут при комнатной температуре с помощью нежного вихря каждые 10 минут.
После инкубации дважды промывайте микросферы 50-миллимолярным MES или буфером связи, pH 5,0, как описано ранее. Повторите стирку дважды. После этого извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте шарики со 100 микролитрами буфера связи вихрем в течение 30 секунд с последующим добавлением нужного количества белка в трубку.
Доведите общий объем до 150 микролитров с буфером связи и перемешайте реакцию вихрем в течение 30 секунд. Затем инкубируют трубку в течение двух часов путем вращения при комнатной температуре. После инкубации дважды промывайте микросферы буфером закалки PBS и повторно суспендируйте промытые микросферы в 100 микролитрах буфера закалки, содержащего 0,05% азида натрия, вихрем в течение 30 секунд.
Подсчитайте количество восстановленных микросфер с помощью автоматизированного счетчика клеток и запишите наблюдаемую концентрацию шариков. Для выполнения анализа повторно суспендируйте связанные микросферы вихрем в течение 30 секунд и обрабатывайте ультразвуком в течение 60-90 секунд. Затем удалите необходимое количество коллоида каждого шарика из соответствующей трубки и объедините шариковые коллоиды в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Затем вставьте трубку в магнитный сепаратор и разрешите отделение в течение 60 секунд. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, удалите супернатант, не нарушая гранулу шарика. После извлечения шариков из сепаратора повторно суспендируйте бусины в 100 микролитрах буфера анализа.
Вихрь в течение 30 секунд перед помещением трубки в магнитный сепаратор на 60 секунд, чтобы отделить шарики. Повторите стирку дважды. Затем отрегулируйте концентрацию трехплексной рабочей микросферной смеси, добавив соответствующий объем буфера анализа для получения конечной концентрации 100 микросфер на один микролитр для каждой цели.
Aliquot 25 микролитров микросферы смешиваются в каждую лунку 96-луночной плиты. Разбавьте образцы плазмы или сыворотки в 500 раз в буфере анализа и подготовьте стандартные образцы в соответствии с желаемым титрованием. Добавьте 25 микролитров буфера для анализа в качестве пустого образца и добавьте каждый из разбавленных образцов или стандарт в каждую обозначенную скважину пластины образца из 96 скважин.
Когда это будет сделано, накройте пластину алюминиевым уплотнением или фольгой, чтобы инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре на пластинчатом шейкере, установленном на 700 оборотов в минуту. Готовят раствор античеловеческих детектирующих антител или вторичных растворов антител по четыре мкграмма на микролитр с буфером анализа, как описано в рукописи. Поместите пластину на магнитный сепаратор для быстрой промывки, а затем принудительно переверните пластину над контейнером с биологической опасностью, чтобы удалить жидкость из скважин.
Когда пластина все еще перевернута, силой постучите по тарелке о толстый кусок бумаги. Затем промыть каждую лунку 100 микролитрами буфера для анализа и удалить жидкость путем принудительной инверсии над контейнером для биологической опасности. Повторите стирку дважды.
После последней стирки выбросьте все использованные пачки бумаги в контейнер с биологической опасностью. Затем добавляют 25 микролитров вторичного рабочего раствора антител в каждую лунку 96-луночной пластины и покрывают пластину алюминиевой фольгой для инкубации на пластинчатом шейкере со скоростью 700 оборотов в минуту. После 30 минут инкубации дважды промыть колодцы тарелки пробирным буфером, как показано ранее.
Затем добавьте 100 микролитров пробирного буфера в каждую скважину 96-луночной пластины. Накройте пластину алюминиевой фольгой и высиживайте в течение пяти минут на шейкере пластины при комнатной температуре. Анализ 60-микролитрового образца с помощью приборного анализатора в соответствии с системным руководством.
Для оптимизации инкубационного времени захвата образца инкубируют пластины в течение 30, 60 и 120 минут. После инкубации анализируют 60 микролитров пробирной смеси на анализаторе. Семиточечная стандартная кривая, основанная на последовательной серии разбавления 1:5, была оценена для спайка S1, мембранных антител и нуклеокапсида.
Тест на точность внутри анализа проводился на пластине для оценки точности анализа, рассчитанной как процентный коэффициент вариации, стандартное отклонение и среднее значение. Для межпробирной точности для каждого анализа были подготовлены три отдельные партии наборов бусин. Были рассчитаны прецизионные переменные анализа со стандартными образцами плазмы и образцами плазмы человека.
Средние значения средней интенсивности флуоресцентной жидкости через 120 минут инкубации были оптимальными для титров IgG для спайка S1, мембраны и антител к нуклеокапсиду, что указывает на быструю кинетику связывания первичных антител. Оптимизация концентрации вторичных антител в двухканальной производительности продемонстрировала широкий диапазон сигналов в линейном измерении для всех концентраций. Здесь показаны наблюдаемые сигналы от различных временных инкубаций вторичных антител и подробности об изменениях сигнала за все время инкубации.
В оценках специфики двухканальных анализов наблюдалось незначительное загрязнение перекрестного сигнала между пустым и одиночным репортерным каналами. На иллюстрации событий сероконверсии после вакцинации против COVID-19 наблюдаемые значения всплеска S1 IgA и IgM были примерно в 40 раз ниже, чем титры изотипа IgG. Этот метод имеет важное значение для мониторинга реакции на вакцины у людей с ослабленным иммунитетом.
Это позволит нам определить, действительно ли эти пациенты защищены этими прививками.
