Ksenopus oositlerinde konneksinlerin ve inneksinlerin heterolog ekspresyonu, boşluk kavşaklarının biyofiziksel özelliklerini analiz etmek için güçlü bir yaklaşımdır. Tekniğimizin temel avantajı, çift saha voltaj kelepçeleri için uygun olan yüksek taraflı bir akım ölçüm yaklaşımı kullanmaktır. Prosedür, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Yuan Shui tarafından gösterilecek.
Yumurtaların% 70 ila% 80'i yaprak döküldüğünde, tüpü hafifçe eğerek enzim çözeltisini boşaltın. Tüpü ND96 çözeltisi ile doldurarak ve ardından çözeltiyi boşaltarak yumurtaları beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, yumurtaları ND96 çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.
Büyük, sağlıklı görünümlü yumurtaları toplamak ve sodyum piruvat ve penisilin streptomisin ile desteklenmiş ND96 çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için temiz bir cam Pasteur pipeti kullanın. 35 milimetrelik bir Petri kabının dibine küçük bir naylon ağ parçası yapıştırarak bir yumurta enjeksiyon kabı hazırlayın. Yumurta enjeksiyon kabını, piruvat ve penisilin streptomisin ile desteklenmiş ND96 çözeltisi ile yaklaşık olarak yarıya kadar doldurun.
Ardından, Petri kabının içindeki sıralara 25 ila 30 yumurta yerleştirin. Bir enjeksiyon mikropipetini hafif mineral yağ ile doldurun ve enjektörün mikropipet tutucusuna yerleştirin. cRNA'yı depolanan alikotlardan birinden, pipetleme yaparak Petri kabı kapağının iç yüzeyine veya tabanına aktarın.
cRNA damlacığını mikropipetin ucuna aspire etmek için enjektör kontrolöründeki doldurma düğmesine basın. Ardından, cRNA'yı enjekte etmek için enjekte et düğmesine basın. Enjekte edilen oositleri, piruvat ve penisilin streptomisin ile desteklenmiş ND96 çözeltisi içeren yeni bir Petri kabına aktarın.
Onları bir ila üç gün boyunca 15 ila 18 santigrat derecede çevre odasının içinde tutun. Yumurtaları yeni bir Petri kabına aktararak çözeltiyi günlük olarak değiştirin. Yumurtayı saran şeffaf villin zarını nazikçe soymak için iki ince cımbız kullanın.
Daha sonra, ND96 çözeltisini içeren bir oosit eşleştirme odasına kuyucuk başına iki yumurta yerleştirin. Diferansiyel voltaj probunu ve akım kablolarını model hücresine bağlayın. Ardından, kırmızı ve siyah soketleri birlikte verilen jumper ile diferansiyel voltaj probuna bağlayın ve jumper'ın her iki bacağını da model hücresindeki her iki pime bağlayın.
Model hücresindeki topraklama kablosunu, amplifikatörün topraklama devresi soketinden gelen kabloya bağlayın. VM ofset ve VE ofset düğmelerini membran voltaj ve membran akım ölçerleri sıfıra çevirin. Kelepçeyi kapalıdan hızlı veya yavaşa çevirin ve kazanç kadranını saat yönünde, amplifikatörün voltaj elektrodunu ve banyo elektrodu ölçerlerini sıfırlamak için uygun voltaj kelepçesine izin verecek bir seviyeye getirin.
Membran gerilim ölçerde görüntülenen voltajın alım protokolüne göre değiştiğini ve voltaj ve akım izlerinin Clampex'te düzgün bir şekilde görüntülendiğini doğrulamak için birkaç voltaj adımı içeren basit bir alım protokolü çalıştırın. Eşleştirilmiş oositleri içeren bir Petri kabını, kayıt platformunun Petri kabı kabına yerleştirin. Bir çift yumurta seçin ve gerekirse Petri kabını döndürün, böylece iki yumurta sol ve sağ yönde olur.
Sahneyi manyetik tabanıyla yerine kilitleyin. Petri kabının kenarına kullanıcı tarafına doğru bir referans elektrodu yerleştirin. Ardından, referans elektrodunu iki diferansiyel voltaj probundan yalnızca birinde siyah sokete bağlayın.
Bir çift cam mikropipet alın, ucun bir kısmını elmas bir yazıcıyla kesin ve uç kenarını ateşle parlatarak pürüzsüzleştirin. Mikropipeti bir alkol brülörünün alevinin üzerinde tutun ve ucundan yaklaşık bir santimetre uzakta yumuşak bir açıyla bükün. Cam pipeti ND96 çözeltisiyle tamamen doldurun ve ardından önceden doldurulmuş bir mikroelektrot tutucuya takın.
Sistemde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Mikroelektrot tutucunun iki milimetrelik pimini bir diferansiyel voltaj elektrot bağlantı kablosunun iki milimetrelik soketine yerleştirin. İki milimetrelik soketi manyetik tabanlı bir kelepçeleyici üzerine sıkıştırın ve diferansiyel voltaj elektrodunun ucunu iki oositten birine doğru hedefleyin.
Diferansiyel voltaj elektrot bağlantı kablosunun bir milimetrelik pimini aynı taraftaki diferansiyel voltaj probunun kırmızı soketine yerleştirin. Voltaj ve akım elektrotlarını cam kılcal damarlardan hazırlayın ve tekrar potasyum klorür çözeltisi ile doldurun. Ardından, elektrotları amplifikatörlerle birlikte verilen elektrot tutucularına yerleştirin.
Elektrotları banyo çözeltisine indirin ve VM ofset ve VE ofset kadranlarını membran voltajını ve membran akım ölçerleri sıfıra indirin. VM elektrot testi ve VE elektrot testine basarak elektrot direncini kontrol edin. Akım ve gerilim elektrotlarını oositlerin içine yerleştirin ve negatif membran potansiyellerini gözlemleyin.
Ardından, amplifikatörün kelepçe bölümünde, DC kazancının yerinde olduğunu onaylayın. Kazanç düğmesini saat yönünde uygun voltaj kelepçesine izin verecek bir seviyeye getirin ve kelepçe anahtarını kapalıdan hızlıya çevirin. Son olarak, bir satın alma protokolü çalıştırın.
Oosit deneyinin bir diyagramı burada gösterilmiştir. Negatif ve pozitif membran voltaj adımları, eksi 30 milivoltluk bir tutma membran voltajından oosit 1'e uygulanırken, oosit 2, eksi 30 milivoltluk sabit bir membran voltajında tutulur. Trans-bileşke voltajı veya Vj, oosit 2'nin membran voltajı eksi oosit 1'in membran voltajı olarak tanımlanır.
Temsili görüntüler, örnek Lj izlerini ve UNC-9 homotipik boşluk bağlantılarının normalleştirilmiş bileşke iletkenliği trans-kavşak gerilim ilişkisini göstermektedir. Örnek Lj izleri ve UNC-7b homotipik boşluk kavşaklarının ortaya çıkan normalleştirilmiş Gj-Vj ilişkisi burada gösterilmiştir. Sonuçlar, bu iki tip Gjs'nin Vj'ye bağımlı Ij inaktivasyon hızı, Vj bağımlılığı ve artık Gj miktarında farklılık gösterdiğini göstermektedir.Prosedürü denerken, diferansiyel voltaj elektrot sisteminin herhangi bir hava kabarcığı olmadığından ve ucunun oosite çok yakın bir şekilde hedeflendiğinden ve voltaj ve akım elektrotlarının yaklaşık bir mikroohm dirence sahip olduğundan emin olmak çok önemlidir.
Tekniğimizin uygulanması kolaydır. Boşluk kavşaklarını incelemek için Xenopus oositlerini kullanmakla yeni ilgilenen laboratuvarlar için özellikle ilgi çekici olabilir.
