Bu makale JER NIH hibe programı tarafından finanse edildi. Ben Dr. Alex Gottschalk kayıt gösterilerin birinde kullanılan kolinerjik motor nöronların kanal rodopsin ifade eden transgenik solucanlar sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.

Diseksiyon için kullanılan aletler, A. hazırlanması. <ol><li> Diseksiyonu / kayıt oda: Biz genellikle, 22 mm çapında yuvarlak cam kapak barındıracak kadar büyük olduğunu merkezi haline delinmiş dairesel bir delik ile, 1 / 16 th inç manyetik levha bizim kayıt odasına oluşturmak . Odanın dış boyutları kayıtları yapmak için kullanılan mikroskop sahne bağlıdır. Manyetik sac ters tarafta, kapağın her köşesinde düşük erime Paraplax doku gömme balmumu bir pelet koyarak odasına bağlı 48 x 60 mm kapak kayma, takmak cam ve oda arasında sıkışmış slip . Sürekli bir kat yapıştırma odasına kapak kayma oluşturur kadar mum sonra, cam levha yukarı bakacak şekilde, sıcak bir plaka üzerinde eritilir. Balmumu çabuk erir gibi bu adımı yalnız bırakmayın. Odasına kaldırıldı ve balmumu eriyene gibi kısa sürede soğutulması gerekmektedir. 22mm yuvarlak boşluğunun iç kenarı boyunca seeped Fazla balmumu bir jilet kenar kullanarak silinebilir. </li><li> Sylgard kaplı kapak fişleri: diseksiyonu ise 22 mm, kayıt odasının dairesel boşluğu içinde yer almakta olup Sylgard kaplı kapak kayma yapılır. Sylgard kat cyanoacrylic tutkal aşağı ve solucanlar bu takılı olduğunda tutkal pipet geri kırmak için bir yastık görevi görür yapıştırma kayma kapağı için uygun yardımcı olur. Sylgard göre taze yapılır talimatları (10 parça silikon taban 1 kilo ajan kür parçası) üretmektedir. Sylgard küçük bir damla, sonra her kapak astar üzerine yerleştirilir ve düz bir yüzey yapmak için jilet kenarı kullanılarak boyunca lekelenmiş. Kaplamalı kapak fişleri büyük düz kapalı kaplarda yerleştirilir ve tedavi için bir gecede 65 ° derece fırında bırakılır. </li><li> Pipetler: Tipik olarak, bir elektrot çektirmenin kullanarak, kaslar kütikula kesiler ve kayıt yapma, aynı 1 mm dış çapı filament borosilikat camdan aşağı yapıştırma solucanlar için pipetler oluşturmak için kullanan. Bu aşamada, pipetler çok hızlı bir değişim gerektiren bir diseksiyon denemeden önce pipetler bir kavanoza çekmek için tavsiye edilir. </li><li> Tutkal aplikatör: Tutkal yüklü ve ağız basıncı ile, bir tutkal pipet ucu uygulanır. Yapıştırma pipet pipet cam (genellikle 1 mm), dış çapı eşleşen bir iç çapı ile polietilen boru, 2 ayak parçasının bir ucunu eklenir. Hortumun diğer ucunda, bir ağız parçası olarak hareket eden bir Eppendorf pipet tutar. </li><li> Ekstraksiyon pipet: kütikül kesi yapıldıktan sonra solucan organlar solucan boşluğu uzaklaştırılmalıdır. Bu boru tutkal benzeri bir Eppendorf pipet bağlı, ancak bu durumda cam çıkarma pipet solucan boşluğuna yumurta ve iç organları dışarı vakumlu kolayca izin için yeterince geri kırık bir parça ile sağlanır. </li></ol> B. disseksiyonu <ol><li> Kayıt odasında dairesel bir balmumu kalem hattı Sylgard kaplı bir kapak kayma sıkıca basıldığında odası (Sylgard kat yukarı bakacak şekilde) çevresine yakın çizilir. Bu balmumu hat kapak kayma durduran ve kayıt altında sızan ve diseksiyon ve kayıt sırasında kapak kayma yerinden oynatmamaya çözümü engeller. Odasına sonra ekstrasellüler kayıt çözümü ile doludur ve çeşitli solucanları bir solucan almak kullanarak yerleştirilir. Worms çözüm yüzmek, ancak uygulama ile bu solucanlar aşağı hareket etmesini önlemek için soğutma gibi başka prosedürler olmaksızın yapıştırılmış olabilir. Eğitim aşamasında, yüzme engelli olduğu yapıştırma mutant solucanlar (unc-31 mutantlar gibi) uygulamaya yardımcı olabilir. </li><li> PCR kap, mum veya modelleme kilden yapılan bir moda bir tutkal kabı, cyanoacrylic tutkal çalışan bir stok tutmak için kullanılır. Tutkal pipetler kayıt pipetler benzer uç boyutları ile (normalde ~ 4 megohms direnç) zamk uygulamak için kullanılır. Tutkal, yapıştırıcı aplikatör kullanarak küçük bir miktar yapıştırıcı emilir pipet görselleştirmek için diseksiyon kapsamı kullanarak, tutkal pipet içine emilir. </li><li> Cyanoacrylic tutkal (HistoacrylBlue, Aesulap) ekstraselüler bir kayıt çözümü ile temas polimerize, bu nedenle sertleştirme tutkal önlemek ve pipet takmayı tutkal pipet pozitif basınç odası çözüm girerken muhafaza etmek önemlidir. En kısa sürede tutkal pipet oda çözümü olduğu gibi, küçük fakat sürekli bir tutkal takmayı önlemek için ağız basıncı kontrol altında Sylgard yüzeyine uygulanması gerekir. Pipet olursa bazen sylgard kaplı cam ucu hafifçe dokunarak serbest olabilir takılı. Bu tutkal solucanlar denemeden önce yapıştırma pratik tavsiye edilir. Rutin, Sylgard yapıştırıcı, solucanlar genişliğinden daha ince çizgiler yapılan harflerle adınızı yazmak durumunda proc hazıryapıştırma solucan manikür eed. </li><li> Bir solucan tutkal için, pozitif basınç, baş veya solucan kuyruk ya küçük bir miktarda tutkal takmak için kullanın ve solucan Sylgard yüzeye hızla aşağı çekecek. Solucanlar kenarına çok yakın kayıt pipetler ile ulaşmak zor olacaktır yapıştırılmış olarak odasının merkezine yakın solucan eklemek deneyin. Sonra, vulva (ventral kas kayıtları için) içe bakan ile bir C-pozisyon içine solucan zorlayarak, sabit bir başlangıç ​​eklenti solucan manikür, dorsal kenarı boyunca tutkal akımı uygulanır. Bu tutkal doğrultusunda herhangi bir boşluk solucan güçlü bir solucan kütikula kesi adım sırasında koparmasını engellemek için, bağlı olduğu o kadar dolu olmalıdır. </li><li> Kütikula kesi yapmak için, elde tutulan bir diseksiyon pipet geçmek. Bu pipet tutkal / kayıt pipetler daha keskin ve kısa, sağlam bir şaft var. Diseksiyon kapsamı yüksek büyütmeli kullanarak, solucanın uzunlamasına eksenine paralel pipet hizalayın ve manikür / tutkal arayüzü kesi solucan (vulva yakın) boyunca orta noktası hakkında ipucu eklemek. Bu kesi kesi noktası üzerinden yumurta ve bağırsakların dışarı atarken solucanları hidrostatik basınç serbest bırakır. Farinks ulaşana kadar, bir mektup açılışına benzer bir dilimleme hareketi ile solucanın baş doğru manikür kesme devam edin. Solucanın iç organları dışarı vakum ekstraksiyon pipet üzerinden geçin. Kesi temizledikten sonra, açılan manikür silindir şeklinde sürdürecek. Sylgard yüzeye manikür kesme kenarından aşağı kaynak nokta taze bir yapıştırma pipet kullanın. NMJs zarar veya alanını kapatmasını engellemek için bu aşamada en az yapıştırıcı noktalar kullanmak önemlidir. Ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kasları maruz kalmaktadır. </li><li> NMJs kapsayan bazal membran kaldırmak odasından ekstraselüler kayıt çözümü emmek ve 10-20 saniye için kollajenaz (ekstrasellüler kayıt çözümü 0.4mg/ml) uygulamak için; kaldırmak ve taze ekstraselüler kayıt çözümü ile birkaç kez yıkayın. Kayıt aşamasına geçin. </li></ol> C. Patch-kelepçe kayıt <ol><li> Solucan merkezi bir 10X objektif kullanarak bir yukarı doğru mikroskop sahnede kayıt odasına yerleştirin. DIC ile 40X su emersion amacı geçin ve vücut duvarı kasları ve sinir kablosu sağlam olup olmadığını kontrol edin. Solucan solucan boylamasına ekseni, elektrotlar, her ikisi de sağ ve sol taraftan tanıtılacak izin kapsamı ön kenarı ile paralel olacak şekilde yerleştirin. </li><li> Yama standart yama klemp teknikleri kullanarak kas. Yaklaşık 4 megohms direnç Kayıt elektrotlar iyi çalışır. Kas membran elektrot dokunduğunda gigohm mühür elde edilinceye kadar, negatif basınç artar. Tam hücreli gerilim kelepçe kayıt modu için, daha fazla emiş uygulamak ve membran zap gigohm mühür rüptüre kadar. İyi bir kayıt, yabani tip erişkin solucanlar vücut duvarı kasları genellikle bir hücre zarı ~ 70 pF kapasitans var ve istikrarlı bir şekilde en az 10 dakika süreyle asgari tutan akımları (~ 50 -60 mV bir holding potansiyeli kaydedilebilir PA). </li><li> NaCl 150, KCl 5, CaCl 2 5, MgCl 2 4 10, glikoz, sakkaroz 5, HEPES 15 (pH 7.3 ~ 330mOsm): ekstraselüler kayıt çözümü (mM) oluşur. Yama pipetle (mM) içerir: KCl 120, KOH 20, MgCl 2 4, TES 5 (N-tris [hydroxymethyl] mthyl-2-aminoethane-sülfonik asit), Dihidrat CaCl 2 0.25, Na 2 ATP 4, sakaroz 36 EGTA 5 (pH: 7.2 ~ 312 mOsm). Not: Bu çözümler yapay GABA reseptör-aracılı akımları içe tutma potansiyeli -60 mV klorür efflux nedeniyle, böylece klorür ile kas hücreleri yük. Bu çözümler Üzerine Çeşitlemeler (Detaylar için yayın bakınız) kullanılmıştır. </li><li> Serbest Uyarılmış. Genelde biz yamalı kas ventral sinir kord anterior ekstrasellüler çözüm içeren ikinci bir elektrot yerleştirin. Bu gevşek yama yapılandırma yabani tip solucanlar maksimum uyarılmış yanıtlar (genellikle 2,0-2,5 nA) elde etmek için, kısa bir süre büyük depolarizan uyaranlara (volt 10s sırasını) (1-2ms) gerektirir. Bu yaklaşımın sınırlamaları şunlardır: 1) Sadece birkaç uyarılmış yanıtlar, sinir kablosunu geri dönüşümsüz hasar ve 2 önce bilinmeyen nedenlerden dolayı teslim edilebilir), sadece kolinerjik uyarılmış yanıtlar bu uyarımı yapılandırmayı kullanarak elde edilebilir. </li><li> Işık kanal rodopsin stimülasyon aktif. Son zamanlarda, Gottschalk laboratuvar ifade alg türetilmiştir ifade 4 sürmek için kullanılan promotor bağlı olarak, nöronlar altkümelerini ışık stimülasyon üzerine membran depolarize kanal rhodopsins. Transgenik solucanlar üretti C durumda elegans NMJ, ya Kolinerjik motor nöron veya GABAerjik motor nöronların kanal rodopsin ifade entegre hatları şimdi available. Kanal rodopsin sadece retina all-trans opsin benzer parçaları ile ilişkili olduğu zaman ışık yanıt, bu uygulama için kullanılan solucanlar retina bezenmiş bakterilerin yetiştirilmesi gerekir. Yeşil ışık nabız sonra sürekli olarak transgenik solucanlar olduğuna bağlı ACh veya GABA ya da uyarılmış salınmasına neden olur kanal rodopsin etkinleştirmek için kullanılabilir. Bu transgenik solucanlar mutant önüne geçilebilir. Önceki elektrik stimülasyonu üzerinde bu tekniğin avantajı; 1) Işık etkinleştirme GABAerjik veya kolinerjik motor nöronların bağımsız olarak incelenebilir ya da serbest Uyarılmış), birçok tekrar uyarılar yapıldı ve 2 sağlayan nöronal hasara neden değildir. </li><li> Hiperozmotik kaynaklı serbest. Kolay-açıklanmaması vezikül havuzu (tüm NMJ Kullanıcı kaydedilen kas üzerine astarlanmalıdır veziküller özetlenebilir havuzu yansıtan), kullanılan Hiperozmatik ekstrasellüler çözüm (ek sakaroz ekleyerek ~ 850 mOsm ayarlanabilir) içeren bir basınç-pipet boyutunu ölçmek için. 1-3 saniye Basınç darbe uygulamaları, yukarıda açıklanan standart çözümleri kullanarak asenkron post-sinaptik olaylar bir baraj üretir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/1165_2009_1_22_3/figure1.png" alt="" width="600" height="449" /> Şekil 1: C. şematik bir bakış elegans diseksiyon ve nöromüsküler kayıt yapılandırma Sylgard kaplı lamel bulaşması cam ve kür boyunca Sylgard bir damla tarafından yapılan gecede prefabrik kayıt odasının dairesel boşluğuna yerleştirilen ve kayıt çözümü ile kaplıdır. Merkezinde yerleştirilen bir solucan, baş veya kuyruk itibaren solucanın dorsal tarafına tutkal uygulayarak bir yapıştırıcı pipet kullanarak Sylgard yüzeye yapıştırılır. Bir kez yapıştırma, manikür ve yapıştırıcı arasında arayüz bir cam iğne ile yapılır ve baş (kırmızı Delikli çizgi) doğru uzatılmış, vulva bitişik bir kesi tamamlandıktan. Iç organları ve vücut boşluğunda yumurta çıkarılması ardından, kesi kesme kenarı nokta-ventral sinir (yeşil) ve vücut duvarı kasları (kırmızı) açığa Sylgard tutkal kaynaklı. Vulva ön ventral-medial kas yama kenetli ve sinir kablosu üzerinden yukarı uyarıcı elektrot yerleştirilir. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/1165/Reprensentative.png" alt="Represenative Şekil" width="600" height="404" /> Tüm hücre, gerilim kenetli vücut duvarı kas kayıtları, her biri için (elektriksel olarak uyarılmış, ışık-uyarılmış ve Hiperozmatik yanıtları) yukarıda açıklanan üç stimülasyon protokolleri gösterilmiştir. Tüm vakalarda ventral medial vücut duvarı kas -60 mV kelepçelenir. A. Wild-tip kas hücreleri genellikle standart kayıt çözümleri endojen içe minyatür sinaptik akımları yüksek oranlarda sergilerler. B. ön ventral sinir kablosunun 2ms depolarizasyon 2-2.5 civarında yabani tip solucanlar nA büyük bir uyarılmış yanıt ile sonuçlanan çeşitli sinapsların senkron salınımına neden olur. A ve B yabani tip izleri, sağ Temsilcisi izleri ciddi koordinasyonsuz bir mutant (unc-18) sinaptik serbest göstermektedir. Panel C kolinerjik nöronlar kanal rodopsin ifade eden bir yabani tip solucanın nöromüsküler kavşak bir ışık uyarılmış yanıt gösterir. A 2ms ışık nabız genellikle 1.5-1.8 nA bir tepki üretir. D. 1s için kas üzerine 850 mOsm Hiperozmatik tuzlu su basıncı ejeksiyon veziküllerin kolay açıklanmaması havuzu temsil eden minyatür sinaptik akımlarının bir asenkron baraj üretir.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Richmond, J. E., Davis, W. S., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (11), 959-959 (1999).</li><li>Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. 1, (2006).</li><li>Liewald, J. F., Brauner, M., Stephens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature methods. 5 (10), 895-895 (2008).</li><li>Lockery, S. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 293, 201-201 (1998).</li><li>Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuron. 31 (4), 617-617 (2001).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Neurosci. 2 (9), 791-791 (1999).</li></ol>

Genetik model organizmanın C, elegans ideal sinaptik proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyon fonksiyonel analizi yoluyla, sinaptik iletim çalışması için uygundur. Burada C. işleyen bir diseksiyon tekniği tarif elegans elektrofizyolojik analizi için erişilebilir NMJs. Ekteki video C. kritik adımlar gösteriyor elegans diseksiyon ve sinaptik aktivitesini ölçmek için kullanılan tipik bir kayıt yapılandırma . Bu tekniği öğrenmeye büyük zorluklar teşkil ü...

dissecting and recording from the c. elegans neuromuscular junction

Nörotransmisyon nöronların hızlı bir zaman ölçeğinde, post-sinaptik hedeflere kimyasal sinyaller aracılığı ile bilgi aktarımı sürecidir. Bu karmaşık bir süreç uygun sinaptik bağlantı, elektrik sinyallerinin iletim, hedeflemesi ve sekretuar veziküller, kalsiyum algılama, vezikül füzyon, yerelleştirme ve postsinaptik reseptörler fonksiyonu emişli sağlamak için çok sayıda pre-ve post-sinaptik proteinlerin koordineli faaliyet gerektirir ve nihayet, geri dönüşüm mekanizmaları. Sinirbilimciler olarak bu adımların her biri işlevi gören proteinler aydınlatmak ve eylem mekanizmaları anlamak için bizim hedefimizdir. Sinapsların elektrofizyolojik kayıtlar sinaptik iletimi sırasında meydana gelen elektriksel olayların altında yatan okumak ölçülebilir sağlar. Moleküler ve genetik araçlar güçlü dizisi ile C sinaptik proteinlerin işlemek için bu tekniği birleştirerek elegans, sinaptik iletim meydana gelen fonksiyonel değişiklikler analiz edebilirsiniz. C. elegans motor nöronlar ve vücut duvarı kasları kontrol hareket, bu nedenle, bu sinaps 1 koordinasyonsuz lokomotor fenotipleri (unc olarak da bilinir) ile mutantları sık sık karıştırmayı sinaptik iletim arasında oluşan NMJs. Unc mutantlar bakteriyel bir besin kaynağı zengin bir kaynağı muhafaza olduklarından, yemek yedikten bazı faringeal pompalama yeteneği korumak gibi uzun süre canlı kalır. Bu gerçeği ile birlikte bu C. elegans çift cinsiyetli olarak var, onları ayrıntılı çiftleşme davranışları gerek kalmadan mutant döl geçmesine izin verir. Bu öznitelikler, son NMJs 2,3,7 tam olarak nasıl unc mutantlar etkisi nörotransmisyon adresi olan bu mükemmel bir model organizma solucanlar kayıt yeteneği ile birleştiğinde. Diseksiyon yöntemi cyanoacrylic NMJs açığa solucan manikür bir kesi yapmak için bir yapıştırıcı kullanarak erişkin solucanlar hareketsizleştirir içerir. C. yılından bu yana elegans yetişkin diseksiyon diseksiyon mikroskop kullanımı ile gerçekleştirilen ve mükemmel el-göz koordinasyonu gerektiren sadece 1 mm uzunluğunda. NMJ kayıtları, tüm hücre sıkma bireyin vücut duvarı kas hücreleri ve nörotransmitter serbest voltaj elektrik stimülasyonu, ışık ile aktive olan kanal rodopsin aracılı depolarizasyon 4 ve olacak bütün bunlar Hiperozmatik tuzlu su da dahil olmak üzere çeşitli stimülasyon protokolleri kullanarak uyarılmış olabilir tarafından yapılır kısaca açıklanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi açıklar<em&gt; Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em&gt; Ve kısaca bu preparat uygulanabilir hangi kullandığı bazı tartışıyor.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

dissecting-and-recording-from-the-c-elegans-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Görüntüleme.  University of Illinois, Chicago. Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi açıklar Caenorhabditis elegans (C. elegans) Ve kısaca bu preparat uygulanabilir hangi kullandığı bazı tartışıyor.

Video: Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Canlı görselleştirme Drosophila Glial nöromüsküler Kavşağı

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Temel

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi