Yazarlar yazının eleştirel okuma Houston laboratuar sayesinde üyeleri istiyorum. Araştırma DWH verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM083999) tarafından desteklenen

1. Yumurtalık Doku Cerrahi Kaldırma <ol class="lalpha"><li> Deney büyüklüğüne bağlı olarak 400-800 ml arasında, oosit kültür ortamı yeni bir parti (Malzeme OCM) hazırlayın. Fenol kırmızısı, koyu kırmızı bir renk (5N NaOH altı ya da çok küçük damla) olana kadar, 7,6-7,8 pH ayarlayın. PH pH elektrodu medya kontamine yılından bu yana ayrı bir tüp içinde kontrol etmek için küçük bir miktarını dökün. OCM 18 ° C&#39;de saklanır ve bir hafta içinde kullanılmalıdır. </li><li> ~ 2L tamponlu anestezik solüsyonu (Malzemeleri) 3-5 kadın ve bir yer seçin. Biz gün ya da ameliyat öncesinde beslenen kurbağa kullanarak kaçınmaya çalışın. Kurbağa anestezi yenik düşen iken,% 70 EtOH, cerrahi alan dezenfekte ve cerrahi aletler hazırlamak. </li><li> 250 sıcak bir boncuk sterilizatör 20 saniyelik daldırma cerrahi aletler sterilize ° C. Aşağıdaki araçların yandan edilmelidir: neşter sapı (# 3) ve blade (# 10 veya 11), Dumont forseps, Bonn iris makası (eğri veya düz), Halsey veya Olsen Hegar mikro iğne tutucu ve dikişlerle birkaç çift. Sterilize aletler steril bir Petri kabı yerleştirin veya steril tutmak için dikiş paketi iç. Iğne iğne tutucu başlamadan önce istenilen açıda tutun. Kolu anahtarlama aletleri olmadan sütür kırpmak için kullanılabilir makas bıçakları, içerdiğinden Olsen-Hegar iğnelikler tercih ediyor. </li><li> 10 dakika sonra cerrahi anestezi düzlemde elde edildiğini kontrol edin. Anestezi kurbağa hareket duracak ve ayak tutam yanıt vermez veya devredildi. Anestezi, işlemleri gerçekleştirmek için yeterli zaman daha fazla 15 dakika sürmelidir. Don uygun cerrahi giydirmek. Bu kişisel tercih ve kurumsal hayvan bakımı kurallarına bağlı olarak temiz eldiven (lateks), laboratuar kat, cerrahi maske, içerebilir. </li><li> Aseptik teknik Not: Kurbağa cilt salgıları aseptik teknik mümkün olduğunca uyulmalıdır rağmen, genellikle ameliyat sırasında kontaminasyon insidansını azaltmak antimikrobiyal peptidler içerir. Cerrahi örtüler kullanılabilir, ancak kurumsal IACUCs tarafından gerekli olmayabilir ve pek yarar sağlamaz. Elinde steril aletleri, dikiş materyali veya kesi sitesi ipuçları dokunmatik Genellikle &quot;ucu tekniği&quot;. Araçlar (boncuk sterilizatör) cilt aşağıdaki kesi tekrar steril edilebilir ve steril bir alana yerleştirerek araçların (örneğin, bir Petri kabında ya da dikiş paketi gibi) benchtop muhafaza edilmelidir. Kurumsal gereksinimleri önemli ölçüde farklı olabilir, bu nedenle kurumların yönergeleri takip edin ve performans ameliyatları öncesinde uygun eğitim alma. </li><li> Anestezik kurbağa ve bir nemli bir cerrahi silin sırt yatma yeri çıkarın. Not. Seyreltilmiş povidin iyot (1:20) veya klorheksidin (% 0.75) durulama cilt temizlenir. Ancak, bu amfibiyenlerin hassas cildine zarar verecek, ticari cerrahi scrubs, sabun ve% 70 izopropil alkol kaçının. </li><li> Orta hatta lateral karın, alt kısmında ciltte kesi ya da küçük bir neşter iris makası kullanarak, küçük bir (1,5 cm 1). Alternatif tarafta aynı kurbağa sonraki kesiler yapılmalıdır, birbirinden aralıklı. Kesikler ya paralel ya da dik orta hatta yapılabilir. </li><li> Iki aşamada deri ve karın kas kesiler olun. Cilt kestikten sonra, kas tabakası ve forseps ile çevreleyen beyaz renkli fasya kaldırın ve yükseltilmiş bir kas kesi yapmak. Makas kullanın ve deneyin bir hızla kesim temiz yara kenarları bırakarak vücut boşluğunda maruz yapmak, düz kesmek. Sadece fasya kesilirse, geri çekilecektir ve dikilmesi daha zor hale getirecek. Kas kaldırma, yanlışlıkla herhangi bir iç organların yaralama önlemeye yardımcı olacaktır. Ayrıca, kas tabakaları içinde görünen herhangi bir lenf kalpleri ve kan damarları aracılığıyla kesme önlemek için deneyin. Bu over kolayca çekilebilir böylece kesi makas ile uzatmak. </li><li> Kesi yapıldıktan sonra Over açıkça görünür olmalıdır. Yumurtalık temin etmek, forseps ile kavramak ve yumurtalık dokusu dışa. Istenilen miktarda doku kaldırılır ve vücut duvarı düzeyinde kesilmiş. Bu, enfeksiyon veya başka komplikasyonlara bir kaynak olabilir, coelomic boşluğuna geri doku şeyler yapmayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında küçük bir parça yumurtalık hemen gözlemlemek ve onların kalitesini test etmek için bir kaç oosit defolliculate. Sağlam olmalı ve eşit boyda ve renklenmesi. Eğer kabul edilebilir, yumurtalık dokusunun istenilen miktarda kaldırmak ve kesi sütür. 90 mm Petri kabı dolduracak kadar genellikle çoğu deneyler için yeterli. Oosit kalitesi şüpheli ise, kurbağa sütür ve farklı bir kadın ile işlemi tekrarlayın. </li><li> Ilk kas ve fasya tabakası dikilmesi kesi kapatın. N takın<html> fasya tabakası geçmesine de dikkat ederek, bir kaç milimetre kesi lateral eedle. Sütürleri sadece kas dokusu gözyaşı ve gevşek gelebilir. Forseps kesi karşı tarafında aşağıda iğneyi yardımcı olmak için kullanın. Özen aracılığıyla tüm yol çekmek için değil, vücut dışından iğne yeniden kavramak ve ile dikiş kuyruk kalır ya da birkaç santim kadar çekin ve bırakın. </li><li> Dikiş basit bir kesintiye desen yara kapatın. Biz cerrah kare knot (resif knot) yapmak için temel bir araç kravat kullanırlar. Döngü iğne tutucu çevresinde dikiş, kuyruk uzun sonuna kavramak ve döngü içinde kendinize doğru çekin ve sıkın. Döngü ve tekrar üzerinden çekin, bu kez sizden uzağa iğne tutucu çekin. Üçüncü bir atış (ilk olarak aynı yönde), ek güvenlik için kullanılabilir. Dikiş, kesin, kısa kuyruk bırakarak ve birkaç milimetre ötede başka bir dikiş kas yapmak. İki sütür küçük sütürler için yeterli; üç büyük olanlar için. Deri tabakası için tekrarlayın. Temel sütür tekniği YouTube&#39;da video gösterileri mevcuttur &quot;alet kravat&quot; için arama; temel tekniği aynı olmasına rağmen, pek çok seçim için vardır. </li><li> Kadın deiyonize su ile durulayın ve serin (18 ° C) su ile dolu bir kurtarma kova onun yerine. Laboratuarda iken, kurbağa kloraminler kaldırmak için Amquel ile tedavi musluk suyu tutulur. Her birkaç dakika hafifçe su kurbağa kaldırın ve anestezi kurtarma göstergesidir gulping ya da şişkin göz hareketleri, bakın. </li><li> Not: kadın operasyonların bir sayıdan sonra iyi oosit üretmek için devam edecek olsa da Survival cerrahi, yumurtalık dokusu elde etmek için kesinlikle gerekli değil. Hayatta kalma ameliyat yapılması da kullanılan hayvanların sayıları aşağı kesecek. Omurgalı hayatta kalma cerrahi yöntemleri, post-op bakım ve izleme hayvan bakım ünitesi ve bir birey izin ameliyatları sayısı için yönergeleri izleyin emin olun. </li></ol> 2. Kültürleme ve Defolliculating Oosit <ol class="lalpha"><li> Ameliyat bittikten hemen sonra, 90 mm ​​çanak başına 5-6 adet küçük parçalara (~ 2 cm 2) ve taze OCM saklamak, yumurtalık alt bölümlere. Bireysel yumurtalık loblar, açık kesilerek dışarı basık ve kare şeklinde parçalara ayrılır. Bu temiz OCM durulanır ve kültür için yemekler konur. Düzleştirme ve yumurtalık kadar bölünebilen kültür ömrünü uzatmak ve defolliculation kolaylaştırır. </li><li> OCM küçük bir yemek için bir lob hareket ettirin ve elle 300-500 oosit defolliculate. Transferi oosit, yangın cilalanmış steril bir pipet kullanarak. Biz pamuk takılı çeşitli kültürlerin kontaminasyonu en aza indirmek için gerekli olduğunu bulduk. 18 oosit Mağaza ° C (orta yemekleri (Falcon 1007)) 100-150 grupları 8 mL OCM. Uygulama ile, 1-2 saat içinde yeterli sayıda oosit defolliculate mümkün olmalıdır. Fertilizable değildir beri Collagenased oosit konak transferi için uygun değildir. </li><li> Yöntemi Defolliculating. Smith ve ark. Açıklanan temel yöntem aşağıdaki saatçiler &#39;forsepsi (İnce Bilim Araçları, 5s Dumont # 4s veya #), (1991) defolliculate. Forseps bir çift (baskın elinde) kullanarak, tam yetiştirilen sahne VI oosit folikül yumurtalık (sap) eklenir yere yakın çevresindeki teka bağ doku tabakası kavramak. Forseps diğer çifti ile ilk çifti bitişik yumurtalık kavramak. Oosit üzerinden çekerek hafifçe folikül katmanı açmak gözyaşı. Doku yavaşça dışarı oosit tease. Başarıyla defolliculated oositlerin oosit sadece folikül katmanı çıkarmadan çıkardı ve görünür kan damarları yoksun olacak daha floppier. </li><li> Not: karşılamak için ipuçları, forseps ipuçları için yeterli ancak çok hafif bir basınç korumak için şarttır. Çok sıkı sürükleyici yeni başlayanlar arasında ortak ve sağlam folikül çekti oosit neden olacaktır. Defolliculating forseps iyi bir çifti için özel olarak tutun. Ipuçları tam olarak yerine getirmeli ve Xenopus embriyolar (Şekil 1) eksplantlar yapmak için forseps biraz blunter olmalıdır . </li><li> Progesteron ve deney iptal ile yaklaşık 20 olgunlaşma oranı düşükse rutin olgun testi (oda sıcaklığında 6-7 saat sonra &lt;% 50). </li><li> Bu noktada, oosit, oligo, morfolino veya mRNA mikroenjeksiyon gibi manipüle edip istediğiniz gibi kültür olabilir. Enjeksiyon prosedürleri laboratuar başına değişir, bu nedenle burada bu tarif olmaz. Oosit OCM bir hafta kadar korunur, ancak izolasyon 96 saat içinde transferi için bunları kullanmak en iyisidir, böylece genel sağlık düşüşler olabilir. </li><li> Hayati boyalar sınırlamalar nedeniyle sadece beş-altı grupları (kontrol dahil), tek bir kadın transfer edilebilir olduğunu aklınızda tutun, buna göre deneyler planı. </li></ol>&quot;&gt; 3 Oosit Olgunlaşma ve Aday Ana Dişiler uyarılması <ol class="lalpha"><li> Oligo tükenmesi bir kurtarma yapmak durumunda oligo ~ 24-48 saat sonra mRNA (genellikle 50-300 pg RNA) enjekte edilir. Oligos bu zamana kadar bozulmuş olacak ve enjekte edilen RNA zarar vermemelidir. </li><li> Akşam transferi gerçekleştirmeden önce, orta yemekler 8 mL OCM (son progesteron konsantrasyonu ~ 2 mcM) oosit progesteron çalışma çözümü (EtOH 1mm) 16 mcL ekleyin. 18 az 10-12 saat inkübe ° C oosit olgunlaşması için izin vermek. </li><li> HCG kurbağa başına 1000 adet ile 3-5 kadınlarda yumurtlama neden enjekte edilir. Bizim deneyleri oosit olgunlaşma ve aynı zamanda etrafında hCG enjeksiyonu yapılır (örneğin, 22:00 -10 PM) ev sahipliği içine implantasyon öncesinde yaklaşık 12 saat, daha iyi çalışmak için görünüyor. RT veya 18 ° C gecede kadın bırakın. </li></ol> 4. Hazırlık ve Oosit Vital Boya Boyama <ol class="lalpha"><li> Transfer sabahı, ~ 45-60 &#39;kurmak ve yordamı gerçekleştirmek için izin verir. Bu noktada, olgun oosit, mRNA demonte veya protein ifadesi etkinliğini daha sonraki analiz için dondurulur. Ayrıca, oosit enfekte olup olmadığını kontrol edin ve iyi bir olgunlaşma oranı (% 50) olduğunu. Enfekte oosit döller. Hayati boyalar (Malzeme) çözülme ve 5 dakika maksimum hızda dönmeye. </li><li> 15 &#39;sallanan oosit yemekleri ve inkübe uygun vital boya (ler) 80 mcL ekleyerek Rengi farklı deneysel gruplar. Bu süre zarfında, ev sahibi kadın ve anestezi başlayın. Yavaş yavaş normal veya hafif bir sıkma ile bol yumurta üreten bir yumurtlayarak bir kurbağa seçin. Konak Yumurta iyi kalite olmalıdır. Dizeleri, yumurta veya ezilmiş yumurta döşeme kadın kaçının. </li><li> Renkli yumurta, taze OCM büyük bir çanak, yıkama ve transfer etmek için önce onları bir kenara kısaca girdap aktarın. </li><li> Oosit nakli için bir oosit (~ 1.5 mm) karşılamak için yetecek geniş delikli steril bir Pasteur pipeti hazırlayın. Elmas kalemle pipet Puan ve temiz kırmak. Yangın cilası, kenarları düzgün kadar özen açılış kapalı eritmek için değil. </li></ol> 5. Oosit Nakli Sahne <ol class="lalpha"><li> Oosit nakli, Bölüm I açıklandığı gibi aynı cerrahi işlemler, yumurtalık kaldırarak yerine, manipüle oosit bir pipet ile vücut boşluğuna tanıtıldı olmasına rağmen kullanır. İdeal olarak, transfer işlemi mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilir ve insizyon boyutu mümkün olduğunca küçük tutulmalıdır. </li><li> Ev sahibi kadın Anesthesize ve cerrahi aletler, I. Bölüm I. kesi daha küçük olabilir açıklandığı gibi olun ve kesi Bölüm açıklanan hazırlamak, ancak transfer pipeti (Şekil 2A) delik sığacak kadar büyük olması gerekir. </li><li> Oosit nakli için, kavramak ve yükseltmek, kas ve fasya flep ve forseps ile yukarıda hazırlanan Pasteur pipeti kullanarak deneysel oosit tanıtmak. Swirl çanak oositlerin merkezi haline onları toplamak ve mümkün olduğunca çok emmek. Tanıtılıyor aşırı sıvı önlemek ve kesi içine pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş oosit vücut boşluğuna (Şekil 2B) damlama izin oosit pipetin ucunu yerleşmelerine izin verir. Her oosit transfer edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Dikilmesi başladı, ya da oosit kesi dökülebilir kadar, herhangi bir zamanda kas tabakası bırakmayın. </li><li> Oosit transfer edildikten sonra, kesi her iki taraf forseps ile kavramak ve bunları bir araya getirmek, oosit vücut boşluğuna yerleşmelerine izin verme. Açıklandığı gibi, ilk düğüm (Şekil 2C) bağlıdır kadar kas ve fasya yukarı doğru gerilimi tutmak için özen dikilmesi başlayın. Bu atılmaktan oosit tutacak ve kesi kenarları eşit olarak iyileşmek için izin verecek. Kas / fasya tabakası başka bir sütür ekleyin ve sonra cilt sütür. </li><li> Kadın deiyonize su ile durulayın ve soğutmalı (18 ° C) Amquel arıtılmış su ile dolu bir kurtarma kovası onu yer. Yukarıdaki gibi anestezi onu kurtarma Monitör. O ameliyattan sonra normal yumurtalarını başlamalıdır. </li><li> Testisler normal prosedürleri kullanarak bir erkek kurbağa alın. Kadar gerekli OCM veya L15 testisler saklayın. Transferi deneyler gübreleme zaman taze testis tercih ediyor. </li></ol> 6. Oosit, Kurtarma ve in vitro Fertilizasyon <ol class="lalpha"><li> Periton kirpikler vücut boşluğunda ön siyon hatası açıklıklar transfer yumurta (ve konağın normal coelomic yumurta) sürücü olacaktır. Renkli yumurtalar normal sıkarak transferi 2-3 saat sonra başlayan geri kazanılabilir. Kadın döşeme durana kadar Yumurta her yarım saatte bir ya da elde edilebilir. </li><li> Gübreleme de bir SPE4 dakika için rm süspansiyon (~ 4 ml 1x MMR). Sel ve 0.1x MMR ile yoğun durulama. Yumurta normalde aktif hale getirmelisiniz ve tutunmaya ~ 1.5-2 saat gübreleme sonra başlayacak. Aktarılan yumurta biraz daha sonra ev sahibi yumurta daha tutunmaya sık sık olacak. </li><li> Ayrı kaplarına normal ve sıralama embriyolar gibi sistein ile jöle kat çıkarın. Bu deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, herhangi bir aşamada yapılabilir. 4-hücreli sahne etrafında çeşitli renk ve geç blastula aşamalarında en zor tanımlamak için genellikle kolay. Temiz 0.1x MMR (orta çanak başına &lt;50), düşük yoğunluklu Kültür yumurta. Bu noktadan sonra, embriyolar tedavi ve normalde manipüle edilebilir. </li><li> Komplikasyonlar için önümüzdeki birkaç gün içinde hayvan tesis etmek ve izlemek için kurbağa dönün. </li><li> Alternatif döllenme yöntemi; yüksek tuz tamponu yumurtlama <ol class="lroman"><li> Kurbağa anestezi kurtarıldı sonra ~ 1L yüksek tuz MMR (1.2x) içine onu yer. Kadın, yaklaşık 4-6 saat boyunca tampon içine yumurtalarını bırakmak için izin verin. 1.2x MMR drenaj ve temiz bir tabak içine renkli yumurta sıralamak, kalan yumurta sıkmak; mümkün olan tüm sıvı çıkarın. </li><li> 0.3x MMR ile iyice yıkayın ve yumurta (10 dakika) aktive kadar 0.3x MMR / sperm süspansiyonu minimal volüm döller. Sel yukarıdaki gibi 0.1x MMR ve kültürü ile. Birçok yumurta aynı sahneyi ya da yumurta manuel ifade donör oosit zarar ihtiyaç vardır, bu seçenek kullanışlıdır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro.">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li><li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+Xdazl,+a+germ+plasm-localized+RNA,+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus.">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li><li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+mother+can+help:+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique.">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li><li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).</li><li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles.">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li><li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+and+oocyte+isolation.">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li><li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability,+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li><li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+beta-catenin+establishes+a+'dorsal+signal'+in+early+Xenopus+embryos.">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li><li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos.">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li><li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+in+Xenopus+embryos:+an+antisense+approach..">Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach..</a> A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).</li></ol>

University Iowa IACUC Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Başarılı bir transfer, gübreleme ve oosit&gt;% 50 (Şekil 3) normal bölünme neden olacaktır. Genellikle% 30-60 arasında transfer edilen oosit neurula aşamaları geçmiş hayatta kalacaktır. Biz genellikle 75-150 çeşitli analiz için yeterli embriyolar verecektir deney grubu başına oosit, (in situ, RT-PCR) gibi fenotip görselleştirme aktarın. Önemli ölçüde daha fazla oosit implantasyon büyük ölçüde verim artışı görünmüyor. Ayrıca, grup başına en az 30 oosit en azından bazı gastrulasyon üzerinden yaptığınız garanti altına almak için transfer edilmelidir. Hayati boyalar boyaları, bazı durumlarda yan etkileri olsa da, genellikle konsantrasyonları ve burada açıklanan koşullar altında embriyoların etkiler yoktur. Klasik, Doğal Kırmızı, güçlü tungsten bazlı ışık kaynaklarına maruz zaman fototoksik özelliklere sahip bildirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, Mir ve Heasman (2008) embriyolar düşük sıcaklıklarda inkübe edilir Bismarck Brown bazı toksik etkilere sahip olduğu bildirilmektedir. Aşırı oosit ölüyor ve aşırı kaçınarak sıcaklık ve aydınlatma gibi temel önlemler hayati boya yan etkileri olasılığını ortadan kaldırmak gerekir. Yöntemin başarı ya da başarısızlık en büyük belirleyicileri donör oosit kalitesi ve ev sahibi kadın. Oositlerin belirli bir toplu döller olup olmadığını belirlemek için hiçbir kusursuz bir yöntem yoktur. Atretik oosit yüksek bir oran ile Yumurtalık kaçınılmalıdır. Ayrıca, biz muhtemelen rezorpsiyonu oluştuğunu belirten yoğun vaskülarize yumurtalık fakir bir başarı oldu. Oosit 18 ° C olarak mümkün olduğunca çok muhafaza ve enfekte veya hasar oosit gübrelemek gibi aksi takdirde sağlıklı koşullarda muhafaza edilmelidir. Ayrıca, laboratuvar, görünür defolliculator daha deneyimli daha iyi sonuçlar elde edilir ve kısa bir zaman dilimi içinde çok sayıda oosit izole ve enjekte edebilir. Benzer şekilde, belirli bir kurbağa iyi bir ev sahipliği yapacak emin asla olmasına rağmen sağlıklı bir yumurta ile ev sahipliği seçmek için dikkat edilmelidir. Defolliculating gibi cerrahın beceri prosedürün başarısı üzerine de bir yatak vardır. Konak anesthesized zaman süresini en aza indirmek, etkili kurtarma ve gübreleme kritik görünüyor. Çeşitli prosedürlerin genel zamanlama, başarılı bir oosit transfer deneyleri için kritik öneme sahiptir. Genel olarak, kısa zaman oosit kültür tutulur, embriyoların genel gübreleme ve sağlığı daha iyi olacak. Antisens oligos kullanarak mRNA demonte deneyleri için, oosit, oligo hedef mRNA ve ciro maksimal tükenmesi için izin oligo enjeksiyondan sonra en az 24 saat kültür olmalıdır. Böylece oosit mümkün olduğunca çabuk defolliculated ve aynı gün içinde enjekte edilmelidir. Tipik bir deneyde, olgunlaşma ve kadınlarda uyarımı Salı akşamı ve Çarşamba sabahı transferi takip oosit izolasyon ve enjeksiyon ile Pazartesi günü başlayacak. Hedef RNA ciro yavaş ya da bol miktarda anne protein varsa, kültür dönemi, 48 hatta 72 saat kadar uzatılabilir. Biz oosit progesteron ile tedavi 12 saat içinde transfer olan en iyi başarı var. Aşırı olgun oosit bozulmaya başlar ve genellikle kötü döller. Biz genellikle progesteron ekleyin ve ~ 18 ° C gecede muhafaza oosit ve kurbağa hem kadın, transferi gerçekleştirmeden önce yaklaşık 12 saat hCG enjekte. Ev sahibi-devret yöntemi başlangıçta yoğun bir çalışma olmasına rağmen, çok zorluk olmadan gerekli temel becerileri elde edilebilir. Bu yöntem için en yaygın kullanımı, belirli anne mRNA&#39;ların antisens oligonükleotid enjeksiyonu azaldı oosit döller. MRNA aşırı ekspresyonu ya da ilaç tedavisi gibi diğer manipülasyonlar yapılabilir. Bunlar çoğunlukla enjeksiyon nedeniyle artmış ekspresyonu veya yumurta karşı embriyolar diferansiyel fonksiyonu için aşağıdaki gübreleme, ile karşılaştırıldığında farklı sonuçlar olabilir. E-cadherin aşırı ekspresyonu (. Heasman ve ark, 1991) ve ultraviyole ışınlama (Holwill ve ark, 1987; Elinson ve Pasceri, 1989), iki ilginç örneklerdir . Laboratuarımızda ön sonuçları da enjekte integraz veya meganucleases kullanarak transgenesis yöntemleri de oosit daha verimli çalışabilir öneririz. Ana transfer tekniği, hem de döllenme öncesi ve sonrası aşamalarda deney sağlar ve böylece, hatta sadece Xenopus sonrası döllenme olayları bakarak diğer organizmalar mümkün değildir anlayışlar sağlayabilir . Geliştirme ve zorluk ve omurgalıların anne etkisi mutasyonlar üretme maliyeti anne sinyal yollarının önemi göz önüne alındığında, bu yöntemin erken gelişim soruşturma yararlı bir araç kalması muhtemeldir. 7. Temsilcisi Results <img src="/files/ftp_upload/1864/1864fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Defolliculating için iyi (üstte) ve kötü (alt) forseps örnekleri. <img src="/files/ftp_upload/1864/1864fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bir ev sahibi kadın kültürlü oosit transferi (A) ana kurbağa karnın alt kısmında küçük bir kesi yapılır. Kas tabakası oosit giriş izin biraz yükselir. (B) oosit hayati boyalı ve kesi yoluyla vücut boşluğuna yerleştirilir. (C), kas tabakası ilk dikiş tamamlanması. <img src="/files/ftp_upload/1864/1864fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Jöle kat çıkarılmasını takiben bölme örnekleri, 8-16-hücreli aşamada transfer oosit.

Çözümler ve yemek tarifleri: OCM (Oosit kültür ortamı, Wylie ark değiştirilmiş, 1996.) <table border="0"><tbody><tr><td> % 70 Leibovitz L-15 orta (L-glutamin içeren) </td><td> (Invitrogen 11.415-064) </td></tr><tr><td> 0.4 mg / ml Sığır serum albumini (BSA, fraksiyon V) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x Penisilin-Streptomisin </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> 5N NaOH ile pH 7,6-7,8 ayarlayın </td></tr><tr><td colspan="2"> 18 ° C&#39;de taze haftalık, mağaza olun </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Marc Modifiye Zil Çözüm; Zuck ve ark, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> pH 7,6-7,8 uyum </td></tr><tr><td> Mağaza, 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestezik çözümü <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzoik asit Etil Ester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0.7 g / L sodyum bikarbonat </td></tr><tr><td colspan="2"> Amquel arıtılmış su içinde çözülür </td></tr><tr><td colspan="2"> Taze haftalık olun </td></tr></tbody></table> Progesteron stokları <table border="0"><tbody><tr><td> % 100 Etanol 10 mM Progesteron (Sigma P-0130) </td></tr><tr><td> 500x bir hisse senedi için% 100 EtOH 1 mM sulandırınız / çalışma çözümü </td></tr><tr><td> -20 ° C&#39;de muhafaza </td></tr></tbody></table> Vital boyalar (Heasman ve ark, 1991 modifiye) <table border="0"><tbody><tr><td> Mavi:% 0.1 Nil Mavi. </td><td> (121.479 Aldrich-5G), </td></tr><tr><td> Kırmızı:% 0.25 Sabit Kırmızı </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown:% 1 Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Yeşil (80 ul mavi + 80 ul kahverengi), </td></tr><tr><td colspan="2"> Leylak (80 mavi + 80 ul ul kırmızı). </td></tr><tr><td colspan="2"> Altıncı renk, Orange (80 ul kırmızı + 80 ul kahverengi) de kullanılabilir, ancak kahverengi ayırt etmek genellikle zordur. </td></tr></tbody></table> Mavi, Kırmızı ve Brown stokları deiyonize su, 50 ml tüpler oluşur sallanan ile 20 dakika inkübe ve klinik santrifüj eğirilir. Süpernatantlar mikrofuge&#39;de tüpler içine aliquotted ve -20 ° C&#39;de saklanır

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Erken gelişim omurgalı maternal miras moleküllerin katkısının incelenmesi genellikle etkisi anne-mutant hayvanlar üretmek için gerekli zaman ve masraf tarafından engellenmektedir. Ayrıca, pek çok teknik Xenopus ve zebrafish gibi organizmaların gen fonksiyonu eksprese veya etkisizleştirmek için yeterince Wnt sinyal gibi kritik anne sinyalizasyon yolaklar hedef başarısız. Xenopus, kültürlü oosit gen işlevi manipüle ve daha sonra onları gübreleme, bu sorunların bir ölçüde iyileştirebilir . Oosit donör yumurtalık dokusu elle defolliculated istediğiniz gibi enjekte veya kültür tedavi ve sonra olgunlaşma ikna etmek için progesteron ile uyarılır. Sonra, ev sahibi fallop borusunda transloke ve modifikasyon ve gübreleme için gerekli jöle kat kazanmak olacak bunun üzerine oosit yumurtladığımı ev sahibi kadın kurbağa vücut boşluğuna tanıtıldı. Oluşan embriyolar daha sonra istenilen aşamaya kaldırdı ve hiçbir deneysel tedirginlikler etkileri için analiz edilebilir. Bu konak-devret yöntemi erken gelişiminin temel mekanizmaları ortaya çıkarılması son derece etkili ve herhangi bir diğer omurgalı model organizmada mevcut değil deneysel olanakları geniş bir yelpazede sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method at JoVE.com

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Gübreleme için Prosedürü<em&gt; Xenopus oositleri</em&gt; Ana aktarma yöntemi.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

14.5K Görüntüleme.  University of Iowa. Gübreleme için Prosedürü Xenopus oositleri Ana aktarma yöntemi.

Video: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biyoloji

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Fare Oosit alımı

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler