David Theilmann (Pasifik Agri-Gıda Araştırma Merkezi, Summerland, British Columbia) bakülovirüs AcMNPV sağlamak ve yararlı bir tartışma için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR), Michael Smith Sağlık Araştırması (MSFHR) Vakfı Enstitüleri ve Doğa Bilimleri Fakültesi ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe tarafından desteklenen .

Bölüm 1: mikroenjeksiyon için Xenopus oosit hazırlanması <ol><li> Xenopus laevis yumurtalık bir küçük parça (yaklaşık 2 cm) 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mm: kalsiyum-ücretsiz modifiye Barth Kullanıcı tuzlu su 20 ml kollajenaz çözüm (5 mg / ml kollajenaz içeren bir 50 ml konik tüp içine yerleştirin MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7.5). Kollajenaz oosit çevreleyen folikül hücreleri çıkarmak için kullanılır. </li><li> Çalkalayıcı platform üzerinde tüp yerleştirin ve bir saat (100 RPM) hafifçe sallayın. Bu sefer farklı birçok kollajenaz ile değişir. Böylece bir saat sonra oosit, küçük bir örnek alır ve onları incelemek diseksiyon mikroskobu altında. Düzgün de folliculated oosit birbirinden ayrılmış olmalı ve bu yumurtanın içine bir bardak iğne eklemek için kolay olmalıdır. Oosit yeterince de folliculated değilseniz, kollajenaz çözüm sol ve her beş dakikada bir tekrar kontrol edilir. </li><li> (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO 4, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.41 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7.5) modifiye Barth en tuzlu oosit üç kez yıkayın, ve bunları aktarmak MBS artı% 1 penisilin / streptomisin içeren bir 100 mm çaplı Petri kabı. Oosit artık microinjected hazır. Mikroenjeksiyon başka bir gün yapılacak ise, bir hafta boyunca, 4 ° C&#39;de oosit saklayın. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak, mikroenjeksiyon için olgun sahne VI oosit seçin. Bu oosit siyah hayvan yarımkürede arasında iyi bir kontrast ve krem ​​renkli bitkisel yarımkürede, büyük. </li><li> Bir kuyu plaka (Nunc, 10 ul iyi hacim) olgun aşamasında VI oosit aktarın. Bu oositlerin undisrupted emme izin sonunda kesilmiş bir pipet ucu ile 200-ul pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Xenopus oositleri Mikroenjeksiyon <ol><li> Mikroenjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için,% 1 bromphenol mavi küçük bir miktar ekleyerek microinjected ithalat substrat hazırlayın. Örneğin, substrat 10 ul bromphenol mavi 1 ul ekleyin. </li><li> 100 mm çaplı Petri kabı Parafilm küçük bir şerit yerleştirin ve Parafilm şerit enjekte edilecek çözümün bir 5-ul damla dağıtmak. </li><li> Enjekte edilebilir bir çözüm ile daha önce kalibre edilmiş bir enjeksiyon iğnesi (enjekte + Matic Çektirme 6.6-ul mikropipet Drummond çekerek edilen) doldurun. Bunun için, mikroenjektör aspirasyon modunda ayarlanır. 50 nl bir birime karşılık her 0.5 mm, enjeksiyon iğnesi kalibre etmek için iğne nokta işaretleri yapmak. </li><li> Sitoplazmik enjeksiyon için, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, hayvan yarımkürede çok yakın, bitkisel yarımkürede bir oosit içine iğne ucu takın. Microinject mikroenjektör ayarı açın ve ithalat substrat 50 nl her oosit microinject. Iğne nokta işaretleri enjekte edilmiştir substrat miktarını izlemek için kullanılır. </li><li> Enjekte edilen oosit MBS ile dolu bir küçük (35 mm çap) Petri kabı Transferi, ve zaman istenilen miktarda oda sıcaklığında inkübe NPC&#39;ler ile ilişkili ithalat yüzey gözlem izin verecek şekilde (zaman noktaları seçilir; Bu durumda proteinler ve aktif NPC doğru taşınır virüsler için 10 ile 30 dakika arasında, bu sefer de) enjeksiyon yerinde ve protein / virüs boyutunu bağlıdır. </li><li> Inkübasyon tamamlandığında, MBS% 2 glutaraldehyde içeren 4 ml cam şişe oosit transferi, ve 4 gecede düzeltmek ° C </li></ol> Bölüm 3: Xenopus oositleri Diseksiyon <ol><li> Ertesi gün, MBS oosit 3 kere yıkayın. </li><li> Düşük tuz tamponu (: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2, 10 mM Hepes, pH 7.5 LSB) ile dolu küçük bir Petri kabı oosit aktarın. Diseksiyon mikroskobu kullanma ve cımbız diseksiyon her oosit bitkisel kutup çıkarın. Diğer çifti makas gibi bitkisel kutup kaldırmak için kullanılır, bir çift cımbız ile disseke oosit stabilize etmek için yararlıdır. Bu noktada sitoplazmada mavi bir belirti varlığı mikroenjeksiyon başarısını değerlendirmek mümkündür. Protokolü sadece başarıyla microinjected oosit devam etmektedir. Buna ek olarak, örnekleri, EM için hazırlıklı olmak, bu diseksiyon adım kırparak ve numunelerin kesit çekirdeğini bulmak için çok daha kolay hale getirir. </li><li> % 2 oda sıcaklığında bir saat LSB glutaraldehid disseke oosit tekrar sabitleyin. </li><li> Fiksasyon sonra, LSB disseke oosit üç defa yıkamak. </li></ol> Bölüm 4: Injected Oosit gömme ve EM İnce-Kesit için hazırlanması <ol><li> Disseke oosit bir depresyon slayt aktarın. Pos olarak sıvı aspire(bu yüzden kurumasına kalmamasıdır) sible ve sonra hızlı bir şekilde% 2 düşük erime agaroz ile disseke oosit kapsar. Agaroz hala yumuşak olmasına rağmen, oosit birbirinden ayırmak için bir pipet kullanın ve her oosit yüzü yukarı veya aşağı olduğunu sağlamak için (yanlara değil). </li><li> Agaroz yaklaşık 10 dakika katılaşmasını sağlayın. Agaroz katılaşır sonra, küçük parçalar halinde, her bir disseke oosit içeren içine agaroz kesmek için jilet kullanın. </li><li> Agaroz gömülü oosit 4 ml cam şişe yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 LSB olarak 4 OsO sonrası onları düzeltmek. </li><li> Örnek LSB üç kez yıkayın. Gerekirse, 4 ° C gecede numune saklamak ve ertesi gün devam protokol. </li><li> Sırayla (20 dakika her biri için 50, 70, ve% 90 etanol), alkol artan serisi örnekleri kurutmak. Bu, 15 dakika her biri için% 100 etanol iki değişiklikleri takip eder. Son 15 dakika için% 100 aseton ile örnekleri kurutmak. </li><li> ,, En az altı saat süreyle 2:1 iki saat EPON ve aseton karışımı ve sonunda saf EPON infiltrasyonu ile takip bir saat 01:01 EPON karışımı (Fluka) ve aseton, örnekleri Infiltrate. </li><li> Taze saf EPON düz gömme kalıplara yerleştirin örnekleri ile dolu. Oosit şekilde odaklı olduğunu enjeksiyon yakın çekirdeğin yan - Bu durumda disseke olmuştur oosit yan ilk kesitli olacak. Bu adım, seçilen substrat ithalat görselleştirme şansı en iyi hale getirir. </li><li> Son olarak, iki gün, 60 ° C için EPON polimerize </li><li> Örnekleri görselleştirmek için, blokları ultramicrotome kullanarak kesilmiş ve sonra kesitli vardır. Bölümler EM ızgaraları, standart prosedür kullanılarak boyandı aktarılır ve bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülendi. Standart EM prosedür olarak protokol bu bölümü görünmeyecektir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Protokolü başarılı olmuşsa, daha sonra nükleer zarf (NE) ve NPC&#39;ler EM mikrograflar açıkça görünür olmalıdır. Substrat enjekte edilir ve enjeksiyon ve fiksasyon arasındaki zaman miktarına bağlı olarak, yüzey NPC, ya da nükleer yüzüne NPC NPC sitoplazmik yüzü görünür olmalıdır. Şekil 1 bir kesit bakülovirüs AcMNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit dört saat 4 ° C&#39;de inkübe komşu sitoplazma (c) ve nukleus (n), KD, ve gömme ve ince kesit için işlenmiş gösterir . EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Kapsid yerleştirme bir NPC sitoplazmik yüzü beyaz bir okla gösterilir. Buna karşılık, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile kesit Şekil 2 KD gösterir ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Bu tekniği kullanarak, MVM KD (Cohen ve Panté, 2005) bozulmasına neden olur ki bulduk. Parantezler NE tatili göstermektedir. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="459" /> Şekil 1: Elektron mikrograf 4 inkübe bakülovirüs Ac MNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ° C, dört saat için işlenmiş gömme ve ince kesit EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Şekil 2" width="600" height="264" /> Şekil 2: Elektron mikrografı, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Arrowheads NPC&#39;ler noktası. Parantezler NE tatili göstermektedir. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm.

<ol>
	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Mikroenjeksiyon ince kesit EM ile birlikte Xenopus oositleri Nükleositoplazmik taşıma çalışmak için son derece etkili bir araçtır . Bu sistem, sitoplazmik filamentler ve nükleer sepeti (Panté 2006) gibi NPC yapısal bileşenleri ile bir nükleer ithalat substrat örnek etkileşim için ithalat farklı adımlar, NPC ile eşleştirmek için kullanılır olmuştur. Aynı zamanda nükleer kopyalayan virüs nükleer ithalat (; Rabe ve ark, 2003; Cohen ve Panté, 2005 Panté ve Kann, 2002) çalı?...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Ince kesit, elektron mikroskobu (EM) tarafından takip Xenopus laevis oositlerin Mikroenjeksiyon Nükleositoplazmik taşıma eğitimi için mükemmel bir sistem. Çünkü, büyük bir çekirdek ve yüksek yoğunluklu nükleer gözenek kompleksler (NPC), nükleer taşıma Xenopus oosit kolayca görüntülenebilmekte . Nükleer ithalat ve ihracat mekanizmalarına daha fazla fikir, bu sistemin kullanımı (Panté 2006) ile elde edilmiştir. Buna ek olarak, çeşitli virüslerin konak çekirdeğinde çoğaltmak nükleer ithalat yolları incelemek Xenopus oositler mikroenjeksiyon kullandık. Burada bir nükleer ithalat substrat Xenopus oositlerin sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir. Ayrıca görünüm için enjekte oosit hazırlanması ince kesit diseksiyonu, dehidratasyon, ve oosit, epoksi gömme reçine içine yerleştirilmesi de dahil olmak üzere, EM. Son olarak, bakülovirüs Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ya da Fare (MVM) parvovirus Dakika Virüs kapsid microinjected ve tekniğinin potansiyel uygulamaları tartışmak oosit temsilcisi sonuçlar sağlar .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes at JoVE.com

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Bir nükleer ithalat substrat yanı sıra görünüm için ince kesit elektron mikroskobu ile enjekte edilen oosit hazırlanması oosit.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Görüntüleme.  University of British Columbia - UBC. İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir Xenopus laevis Bir nükleer ithalat substrat yanı sıra görünüm için ince kesit elektron mikroskobu ile enjekte edilen oosit hazırlanması oosit.

Video: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Biyoloji

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...