Protein agregasyon mekanizmaları şimdiye kadar çoğunlukla in vitro olarak araştırılmıştır. Protokolümüz ile model organizma C.elegans'ta da benzer nicel çalışmalar yapabiliriz. Yöntemimizin temel avantajı, dahil etme sayılarının tarafsız bir şekilde ölçülmesidir.
Ve bu yüksek kaliteli verileri matematiksel modellere uyarlayarak, toplama mekanizması hakkında fikir edinebiliriz. Protein agregasyonu, Alzheimer ve Huntington dahil olmak üzere birçok hastalıkta görülür. İn vivo protein agregasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak, yeni tedaviler geliştirmek için çok önemlidir.
Senkronize bir yumurtlama gerçekleştirmek için platin solucanı toplama ile 6 cm'lik tohumlanmış bir NGM plakasına 10 yetişkin nematodu yerleştirerek başlayın. Yetişkinleri plakadan çıkarmadan önce 20 C'de yaklaşık iki saat yumurta bırakmaya bırakın. Yumurtalı plakaları 20 C'de inkübatöre yerleştirin.Yumurtlamadan yaklaşık üçüncü gün sonra yetişkinliğe ulaşana kadar hayvanların gelişimini izleyin.
Gerekli sayıda kuyucuğu anestezik olarak 25 mM sodyum azid ile desteklenmiş 100 L M9 tamponu ile doldurarak 384 delikli plakayı hazırlayın. Görüntülenecek gerinim başına bir kuyucuk doldurun. Her suş için, bir platin solucan toplama kullanarak 20 hayvanı bir kuyuya aktarın.
Buharlaşmayı önlemek için plakayı kapakla örtün ve plakayı hazırlandıktan sonra bir saat içinde görüntüleyin. Cihazı açın ve yazılımı açın. Kuyu Plakalarını Boşalt'ın yanındaki Oynat düğmesine tıklayın ve 384 delikli plakayı mikroskopa yerleştirin.
Eylem Listesi ve 3B Floresan Alma altında, Test'i tıklatın ve solucanlar içeren kuyuyu seçin. Görüntü işleme'yi Hiçbiri olarak ayarlayın. Ve tıklayın Oynat solucanların doğru şekilde ortalandığı en uygun kaydırma mesafesini belirlemek için düğmesine basın.
Z-yığınındaki hayvanların tüm kalınlığını yakalamak için Artan Mesafeyi 50 m'ye, Alçalan Mesafeyi 50 m'ye ve Dilimleme Aralığını 2 m'ye ayarlayın. Görüntü İşleme'yi tekrar Maksimum olarak ayarlayın. Kuyu Plakası Tarama Ayarı altında görüntülenecek kuyucukları seçin.
Ve sonra Karo ve Tüm Kuyuyu Edin'i seçin. Ölçüm ayarını kaydedin. Denemeyi başlatmak için Ölçümü Başlat'ı tıklayın.
CellProfiler'ı açın ve işlem hattını Buraya bir işlem hattı dosyası bırak penceresine sürükleyin. Projeyi yüklemek için Evet'i tıklatın. Ardından, dikişli görüntüleri Dosyaları ve klasörü buraya bırak penceresine sürükleyin.
Meta veri giriş modülüne tıklayın. Dikişli görüntülerin adlarına göre dosya adından ayıklamak için Normal ifade'yi ayarlayın. NamesAndTypes giriş modülünü tıklatın ve Dosya adlarındaki kanallarla eşleşmesi için Kural ölçütlerini seçin'i ayarlayın.
Ardından, çıktıyı CellProfiler'dan kaydetmek üzere bir klasör seçmek için Çıktı Ayarları'na tıklayın. İlk görüntüleme veri kümesini kullanarak ardışık düzenin ayarlarını kontrol etmek için Test Modunu Başlat'a tıklayın. İşlem hattında çalıştırmak için Adım'a tıklayın, her seferinde bir modül.
Solucan anahatlarını ayarlamak için, talimatları görmek üzere EditObjectsManually modülünde Yardımı Göster'e tıklayın. Anahatları düzeltin. Ardından işlem hattını çalıştırmaya devam etmek için Bitti'ye tıklayın.
Test Modundan Çık'a tıklayın ve görüntüleri analiz edin. Çıktı dosyalarını görüntülemek için çıktı klasörünü açın. Ayrıca, solucanların ve eklemelerin doğru şekilde üst üste bindirilip bindirilmediğini kontrol etmek için görüntüleri orijinal dosya adıyla ve ardından anahatlarla açın.
AmyloFit'i kullanmaya başlamak için projeyi adlandırın ve Proje oluştur'a tıklayın. Açmak için Aç'a tıklayın. Ve bir ad vererek ve Oturum oluştur ve yükle'ye tıklayarak bir oturum oluşturun.
Veri ekle'yi tıklayın ve sol panelde gösterilen veri biçimi gereksinimlerini izleyerek hayvan başına ortalama ekleme sayısını içeren dosyayı yükleyin. Ardından, Yeni veri yükle'ye tıklayın. Sıfır noktası uzaklığı için puan sayısı'nı 0 olarak ayarlayın ve dahil etme sayısı verileri için gerekli olmayan ön işleme adımlarını atlamak için plato için ortalama puan sayısını 0 olarak ayarlayın.
Ardından, Gönder'e tıklayın. Her protein konsantrasyonu için bu adımı tekrarlayın. Model panelinde Özel'i seçin.
Denklem kutusuna bağımsız çekirdeklenme denklemini girin. Ve Modeli yükle'ye tıklayın. Ncells için, parametre türünü Global Sabit olarak ayarlayın ve Değer'i vücut duvarı kas hücrelerinin sayısına karşılık gelen 95 olarak ayarlayın.
Parametre türlerini Kcell ve n için Global fit olarak ayarlayın. Ve m için Sabit'e. Sol paneldeki farklı gerinimler için m değerlerini girin.
Havza atlama sayısını değiştirmeden bırakın ve Sığdırma panelinde Sığdır'ı tıklatın. Son olarak, Verileri İndir ve Sığdır'ı tıklatarak sığdırmayı ayıklayın. Dahil etme sayıları, farklı Q40 konsantrasyonlarını ifade eden dört C.elegans suşunda izlendi.
Bağımsız çekirdeklenme modeli, toplama kinetiğini iyi tanımlar. Uyum, 2.1'lik bir reaksiyon sırası ve 1 mM'lik bir hücre içi protein konsantrasyonunda hücre başına günde 0.38 moleküllük bir çekirdeklenme hızı verdi. Önceki bir çalışmada iki bağımsız biyolojik replikasyon, reaksiyon sırası ve çekirdeklenme hızı için yakından karşılık gelen değerleri göstermiştir.
Akılda tutulması gereken bir şey, güvenilir uyumlar elde etmek için çoklu protein konsantrasyonları için yüksek kaliteli veri setlerine ihtiyacınız olmasıdır. Bu yöntem, genetik nakavtlar veya küçük molekül tedavileri gibi canlı bir organizmada protein agregasyonuna müdahale etmenin yollarını bulmak için kullanılabilir.
