In vivo FPOP protein-protein etkileşimleri ve Protein yapısı C-elegans değişiklikler. Bu hayvanlar yaygın insan hastalığı çalışma için bir model sistem olarak kullanılır. In vivo FPOP'u kütle spektrometresi ile birbiriyle kaplayarak, canlı bir hayvandaki farklı hücresel ve vücut bölmelerindeki protein-protein etkileşimlerini belirli bir proteini izole etmeye gerek kalmadan inceleyebiliriz.
Florlu etilen propilen veya FPP boru iki santimetre lik bir parça keserek akış sistemi montaj Başlayın. Borunun bir ucundaki iç çapı genişletmek için temiz bir kesme iğnesi kullanın ve yaklaşık 15 milimetre uzunluğunda küçük bir krater oluşturarak. Akış sisteminin infüzyon hatlarını oluşturmak için, 250 mikrometre iç çaplı 15 santimetrelik parçalara bölünürse, silika seramik kesici ile kaynaştırılmış.
Ve iki kılcal damarı kendinden yapışkanlı bantla birlikte bantlayın, uçlarının %100 kızardığından emin olun. FPP boru krater içine iki kılcal yerleştirin, çok kenarına kadar iterek. Temiz bir yüzeye epoksi reçine küçük bir nokta yerleştirin ve diseksiyon iğne ile karıştırın.
Rekarinin küçük bir damlasını hızlı bir şekilde yerleştirmek için aynı iğneyi kullanın, infüzyon kılcal damarların sonunda, FPP tüpüile bağlantı kuracakları yerde, resenin çıkış tarafını birkaç dakika boyunca kurutmasını bekleyin. Bu arada, akış sisteminin çıkış kılcal olacak yeni bir 250 mikrometre iç çaplı kılcal kesti. Rezorin kuruduktan sonra, yeni kılcal damarı FPP boru çıkışının ucuna takın.
Çıkış kılcal ve iki infusing kılcal damarların iç uçları birbirine karşı floş olmalıdır, karıştırma çay oluşturma. Daha önce açıklandığı gibi taze epoksi reçine ile kılcal ve FPP tüp bağlanın ve akış sistemi gecede kurumasını bekleyin. Proteinlerin in vivo hızlı fotokimyasal oksidasyonu sırasında bu şırınga yerleşme solucanlar engelleyecek bir beş mililitreşşli şırınga içinde, dört manyetik karıştırıcılar takın veya in vivo FPOP.
Bu ve M9 ile ek bir beş mililitreşşüş doldurun, kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için emin olun. Her şırıngaya daha düşük bir adaptör bağlayın ve parmaklarının sıkı olduğundan ve yerinde sabitlediğinden emin olun. Daha sonra, tek bir üç-iki vana orta bağlantı noktasına her şırınga takın.
Her şırıngayı çift şırınga pompasına sabitleyin ve itici bloğunaşırı basıncı önlemek için mekanik rengi ayarlayın. Her üç-iki vana üst portu için daha önce yapılmış mikroakışkan sistemin her infusing kapiller ucunu eklemek için FEP kol ve süper flanş listesi değişkendeğil süper flanş listesi kullanın. Son olarak, valf alt portuna 10 santimetre 450 mikrometrelik iç çap kılcal damar takın, bu da geri çekilen numune kapilleri olarak hizmet verecek.
Pompa akışını başlatın ve sızıntılar için tüm bağlantıları görsel olarak inceleyin. Deneysel akış hızını kullanarak en az üç şırınga hacmi akışı. Akış yolu üç-iki valf sapı üzerindeki oklarla işaretlenir ve her şırınga, valf kolunun sınır dışı edilmesinden geri çekilme pozisyonuna taşınmasıyla el ile doldurulabilir.
Mikroakışkan akış sistemini inceledikten sonra, onu deneysel tezgaha taşıyın ve çıkış kılcal damarını paslanmaz çelik birleşimle yayılan aşamaya sabitleyin. Lazer ışınlama penceresinde erimiş silika nın kaplamasını yakmak ve yanmış kaplamayı tiftik dokusu ve metanolile temizlemek için uzun ömürlü bir çakmak kullanın. Manyetik karıştırıcı bloğunu şırınganın üzerine manyetik karıştırarak yerleştirin ve hızı ayarlayın, böylece karıştırmalar yavaş ve sürekli döner.
Kripton florür excimer lazeraçın ve tiroid tron ısınmak için izin. Lazer enerjisini en az 100 darbe için 50 hertz frekansta, optik sensörü ışın çıkış penceresine yerleştirerek ölçün. 500 mikrolitrelik bir hacimdeki yaklaşık 10.000 solucanı numune şırıngayına elle çekin.
Daha sonra hava kabarcıkları önlemek için emin olun, M9 tampon 2,5 mililitre ile doldurun. En az 10.000 solucan büyüklüğünde bir örnek boyutuna sahip olmak önemlidir. Daha küçük bir örneklem büyüklüğü aşağı proteomik analiz için düşük protein verimi neden olacaktır.
İkinci şırıngayı 200 milimolar hidrojen peroksitin üç mililitresi ile doldurun. Çıkış kapiller sonunda, 40 milimolar DMTU altı mililitre ile 15 mililitrekonik tüp yerleştirin, 40 milimolar PBN, ve 1% zaman elma püresi oksit. Excimer lazerini yazılım penceresinden başlatın, ilk darbeyi bekleyin ve çift şırıngadan numune akışını başlatın.
Numunenin tamamını 15 mililitrelik tüpte toplayın ve herhangi bir görsel sızıntı için numune akışını aktif olarak izleyin. Vivo FPOP'tan sonra solucanları 805 kez g'de iki dakika santrifüj ile peletleyin. Söndürme çözeltisini aspire edin ve 250 mikrolitre lisanslı tampon ekleyin.
Numuneyi temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın, flaşı dondurun ve numune sindirimi kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. iki farklı iç çapa sahip kılcal damarlar kullanılarak in vivo FPOP sonrası solucan geri kazanımı karşılaştırıldı. 250 mikrometre lik iç çaplı kılcal damar kullanıldığında, iki biyolojik kopyada toplam %63 ile %89 arasında bir numune geri kazanımı sağlanmıştır.
150 mikrometrelik iç çaplı kılcal damar kullanımı sadece %21-31 oranında iyileşme ile sonuçlandı. Daha büyük bir iç çaplı kılcal kullanımı, in vivo FPOP sırasında daha iyi solucan akışına yol açar, küçük kılcal tek solucan akışı için izin vermez, ve birden fazla solucan lazer yayılan pencerede birlikte akan görülür, hangi solucan başına lazer maruz kalma miktarını azaltır. Bir FPOP modifiye ve değiştirilmemiş peptid in iyon kromatogramları ayıklanmış hidroksil radikal oksidatif modifiye peptidlerin kimyasını değiştirerek onları daha kutupsal hale gösterdi.
Ters faz kromatografisinde in vivo FPOP modifiye peptidler, değiştirilmemiş peptidlere göre daha erken retansiyon sürelerine sahiptir. İzole peptidlerin MS parçalanması, oksidatif modifiye kalıntıların belirlenmesiiçin izin verir. In vivo FPOP, C-elegans içinde iki biyolojik kopya arasında toplam 545 proteini oksidatif olarak modifiye etmiştir.
Bu protein ayak izi yönteminin bir avantajı, solucanlar içinde vücut sistemlerinin çeşitli proteinleri değiştirmek için yeteneğidir. Tandem MS analizi in vivo FPOP probu solvent erişilebilirliğini in vivo doğrular. Miyozin şaperon proteini UNC 45 ile kompleks olan 90 ısı şok proteininin oksidasyon paterni analiz edildi ve oksidatif olarak modifiye edilmiş dört kalıntı bulundu.
In vivo FPOP için C-elegans kullanımı, hastalık patogenezinde protein-protein etkileşimleri ve protein yapısının rolünü inceleme potansiyeli sunar.
