Bu protokol, C.Elegans'ı vücut duvarı kaslarının in vivo kalsiyum görüntülemesini gerçekleştirmek için seferber etmek için iki yöntem sağlar. Bu yöntem kalsiyum homeostaz ve kalsiyum kullanımı ile ilgili soruların cevaplandırılmasına yardımcı olabilir, ve genetik olarak izlenebilir organizmada erişilebilir bir sinaps. Bu teknik kas kalsiyum homeostaz düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir, ve bu nedenle, kalsiyum bisiklet yanlış düzenleme yoluyla uyarma daralma kaplin etkisi koşulları veya moleküler yolların belirlenmesinde önemli olabilir.
Bu yöntemler, nörobiyoloji, gelişim biyolojisi ve hücre biyolojisi de dahil olmak üzere, ancak sınırlı olmamak üzere araştırma alanları hakkında bilgi sağlayabilir. Bu teknikler çeşitli hücre tipleri ve C.elegans, diğer ilgili nematodlar ve filsafat larvaları incelemek için uyarlanabilir. Deneycinin diseksiyon tekniğini anlayabilmesi ve düzgün hareketsiz hayvanlardan kalsiyum geçicilerini doğru bir şekilde değerlendirebilmesi için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.
Floresan görüntüleme için mikroskobu kurarak başlayın. Kalsiyum seviyelerindeki hızlı değişimleri izlemek için 100 hertz'de tam kare görüntüleme yeteneğine sahip bilimsel bir CMOS kamera kullanın. ImageJ'de çalışan bir micromanager yazılımı ile kamera edinimi ve LED floresan uyarma kontrol edin.
Floresan uyarmaları kontrol eden harici zamanlama darbelerini yönetmek için harici bir açık kaynak mikrodenetleyici panosuna bağlanan açık kaynaklı elektronik platform eklentisini kullanın. Zamanlama mantığını kontrol etmek için, üreticilerin talimatlarına göre yazılımdaki micromanager satın alma protokolünü etkinleştirin. Mavi ışık ile kanal rodopsin uyarmak ve RCaMP değişiklikleri kaydetmek için iki LED kullanın.
470 nanometre ve bir bandpass filtresi nin en yüksek kabul dalga boyu ile LED'li kanal rodopini etkinleştirin ve 594 nanometre lik en yüksek kabul dalga boyuna ve bandpass filtresine sahip bir LED ile RCaMP'yi heyecanlandırın. Her iki LED'i de aydınlatın ve ışığı dikroik ışın birleşimleyici kullanarak aynı optik yola iletin. Led aydınlatmanın zamanlamasını, el yazması talimatlara göre TTL sinyalleri tarafından kontrol edilen katı hal anahtarları ile kontrol edin ve LED yoğunluğunu mevcut kontrollü yük gürültüsü doğrusal güç kaynaklarıyla ayarlayın, ardından mavi ışık simülasyon protokolünü bir simülatöre programlayın.
Bu deneyde, sadece RCaMP floresansını iki saniye yakaladıktan sonra mavi ışık simülasyonuna açın ve kanal rodopsinini etkinleştirmek için 50 milisaniye aralıklı beş, iki milisaniyelik mavi ışık darbelerinden oluşan bir tren kullanın. Diseksiyon preparatını kullanıyorsanız, düşük ışıkta C.elegans diseksiyonu yapın. El yazması talimatlara göre hazırlanan bir milimole kalsiyum ekstrasellüler çözeltisi ile doldurulan silikon kaplı kapak tabanı ile diseksiyon kabına hayvanları yerleştirin.
Solucanın sırt tarafı boyunca mavi boyama ile sıvı topikal deri yapıştırıcı kullanarak hayvanlar aşağı tutkal. Ve cam iğneler kullanarak tutkal ve solucan arayüzü boyunca yanal bir mitikül kesi yapmak. Solucan boşluğundan iç vissera temizlemek için bir ağız pipet kullanın, sonra görüntüleme için ventral medial vücut duvar kasları ortaya çıkarmak için hayvanın mitikül flep aşağı tutkal.
Nano-boncuk hazırlık kullanıyorsanız, 100 mililitre son hacmine distile su kullanarak erimiş% 5 Agra çözeltisi olun. Bir cam slayt üzerine erimiş-Agra çözeltisi bir damla yerleştirmek için bir Pasteur pipet kullanın ve hemen bir bile Agra's pad oluşturmak için hafifçe basınç kullanarak üst üzerinde ikinci bir cam slayt yerleştirin. Üst kaydırağı çıkarın ve yaklaşık dört mikrolitre polistiren nano-boncukları pedin ortasına kadar çıkarın.
Düşük ışıkta nano boncuk çözeltisine dört ila altı C.elegan ekleyin, hayvanların üst üste yatmadığından emin olun ve dikkatlice üstte bir kapak kayması yerleştirin. Görüntüye hazır olduğunuzda, hazırlanan slayt veya diseksiyon kabını mikroskoba yerleştirin ve 10 kat büyütme ve loş parlak alan aydınlatması kullanarak bir solucanı bulup odaklanın. Vulva'nın ön ve doğru ses düzleminde ventrum medial vücut duvar kasını belirlemek için RCaMP floresan uyarmada 60 kat büyütmeye geçin.
Daha sonra, geçişi çekerek ve veri toplama yazılımı içinde canlı tıklayarak görüntü yolunu göz parçasından kameraya değiştirin. Veri toplama yazılımındaki ORI düğmesini tıklatın ve üzerinde durulmakta olan kas ın etrafında bir kutu oluşturun. Uyarıcıda, önceden programlanmış mavi ışık stimülasyon yolunu açın ve görüntüyü yakalamak için görüntüleme yazılımına Edin'i tıklatın.
C.elegans all-trans retinal üzerinde yetiştirilen, başarılı retina içeren ve kanal rodopsin aktive, bir kalsiyum geçici uyarılmış olabilir. Hayvanlar all-trans retinal maruz kalmazsa hiçbir kas kalsiyum geçici tetiklenir. Bu protokol, sca-1 geni tarafından kodlanan sarcoplasmic retikulum kalsiyum pompasını etkileyen sca-1 mutantlarının fonksiyon kaybını araştırmak için kullanılmıştır.
Ancak, rcamp floresan temel düzeylerinde diseksiyon hazırlık artışları kontrol ile karşılaştırıldığında mutant gözlendi, mutasyon istirahat sitoplazmik kalsiyum yüksek düzeyde ihtiyacı düşündürmektedir. Sca-1 mutantlarında kontrole göre en yüksek kalsiyum düzeylerinde önemli bir düşüş yaşandı. Ancak, yükselen zirve süresi veya yarı çürüme süresi hiçbir değişiklik görüldü.
Daha da önemlisi, benzer sonuçlar daha az teknik olarak zorlu nano-boncuk hazırlık kullanılarak görülebilir. C.elegans'ta kalsiyum işlemeyi dolaylı olarak etkileyen mutantları araştırmak için kalsiyum aktive edilen büyük potasyum kanallarını bozan fonksiyon kaybı slo-mutantların kaybı değerlendirildi. RCaMP'nin temel seviyeleri ölçüldüğünde mutantlar kontrollere göre floresan artışı gösterdiler.
Kalsiyum geçici kinetik leri değerlendirilirken en yüksek kalsiyum düzeylerinde herhangi bir değişiklik görülmedi. Slo-1 (örneğin142)mutantlar, ancak, pik zaman önemli ölçüde artış sergiledi. İşlemi tamamlarken hatırlanması gereken en önemli adım, deneysel hayvanları tüm trans retinada hazırlamaktır.
Bu adım olmadan kanal rodopsin inaktif olacak, ışık kaynaklı kalsiyum geçici tetiklenen önlemek. Bu işlemden sonra, kalsiyum homeostazında gözlenen değişikliklerin fonksiyonel etkisini değerlendirmek için elektrofizyoloji ve davranış analizi yapılabilir. Burada özetlenen immobilizasyon yöntemleri kullanılarak, kalsiyum dinamiklerinin daha fazla araştırılmasının önünü açmakta ve çok daha az zorlu boncuk immobilizasyon tekniği kullanılarak optogenetik nöronal stimülasyon ayan kas kalsiyum geçicilerinin yakalanmasına yanıt olarak karşılaştırılabilir sonuçlar gözlemlenebildiği gösterilmektedir.
