Protokolümüz, farklı iklim bölgelerinden elde edilen toprak örneklerini kullanarak topraktaki maya ve küf çeşitliliğini araştırmaktadır. Bu, çevresel maya çeşitliliği hakkında bilgi sağlar ve patojenik türlerin izlenmesine yardımcı olur. Protokol, topraktan maya ve küf toplamak için uygun maliyetli ve hızlı bir yöntem sunar.
Toprak örnekleri, yedi gün gibi kısa bir sürede izolatlar elde etmek için tamamen işlenebilir. Kültür tüplerini etiketlemek ve medyayı bir gün önceden hazırlamak gibi iyi organize edilmiş deney düzeneği, deney sırasında bunalmış hissetmekten kaçınmanın anahtarıdır. Bir dizi steril 13 mililitrelik kültür tüpü hazırlayarak başlayın.
Bunları toprak numunesi kimliği ile etiketleyerek, her tüpte kloramfenikol ve benomil ile desteklenmiş beş mililitre Maya Ekstraktı-Pepton-Dekstroz suyu eklemek için serolojik bir pipet kullanın. İkinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, steril bir ahşap düzlem ucu aplikatörü kullanarak yaklaşık 0,1 gram toprağı uygun kültür tüpüne aktarın. Tüpü ilk durağa kadar güvenli bir şekilde kapatın, inkübasyon sırasında hava değişimine izin verirken dökülmeyi önleyin.
Daha sonra, kültür tüplerini maya büyümesini en üst düzeye çıkarmak için optimum kabul edilen bir sıcaklıkta 24 saat boyunca bir makaralı tamburda inkübe edin. Daha sonra, süpernatantı katı ortama aktarmadan önce kloramfenikol ve benomil takviyeli maya ekstraktı pepton-dekstroz agar plakalarını toprak numune kimliği ile etiketleyin. Kültür tüplerini makaralı tamburdan çıkarın.
Daha sonra, ikinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, altta yerleşmiş olabilecek toprak parçacıklarını ve hücreleri süspansiyona geri çekmek için tüpü kısaca vorteksleyin. Daha sonra, süpernatantın 100 mikrolitresini bir mikropipet kullanarak bir plakaya aktarın. Sıvıyı agar yüzeyine iyice ve eşit bir şekilde yaymak için steril bir yeniden kullanılabilir hücre yayıcı kullanın.
İki ila üç günlük yeterli inkübasyon süresine izin verdikten sonra, plakaları ikinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içindeki herhangi bir maya büyümesi açısından inceleyin. Bakteri ve küf kolonilerinden kolayca ayırt edilebilen kremsi, yuvarlak, mat benzeri mayalar arayın. Steril ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanarak her plakadan bir maya benzeri koloni seçin.
Seçilen her koloniyi, kloramfenikol ve benomil ile desteklenmiş taze bir maya özü peptone-dekstro agar plakalarına ve tek koloniler için çizgiye aktarın. Üç ayrı çizgi uygulayın ve her çizgi için yeni bir aplikatör çubuğu kullanın. Daha sonra, bir koloni polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için bir plaka üzerinde geliştirilen taze hücreleri kullanın.
Mantar barkod genini yükseltmek için dahili transkriptlenmiş ara parçalar ITS1 ve ITS4 primerleri kullanın. Maya suşlarının elde edilen dahili transkriptlenmiş aralayıcı dizisini, tür kimliğini oluşturmak için Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi GenBank ve UNITE gibi halka açık veritabanlarında depolanan iki diziyi karşılaştırın. Bir mililitre Sabouraud dekstroz suyu içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toprak ekleyin ve iki ila dört gün boyunca 50 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Miseliyi toprakla aşılanmış et suyundan malt özü agar plakalarına aktarmak için, önce görünür misel büyümesine sahip toprak inokülumlarını tanımlayın, Sabouraud dekstroz suyunu hava sınırına ekleyin. Daha sonra miseliyi bir malt özü agar plakasının merkezine aktarmak için sterilize edilmiş ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanın ve bu malt özü agar plakasını üç gün boyunca 37 santigrat derece ayarlanmış kuluçkaya yatırın. Misel seçimi için, Aspergillus fumigatus morfolojik özellikleri ile, karakteristik yeşil sallanan benzeri büyümeye sahip küf kolonilerini tanımlayın.
İkinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, sterilize edilmiş ahşap düzlem ucu aplikatör çubukları veya bir aşılama döngüsü kullanarak yüzeyi bir kez kazıyarak konidia veya miselya toplayın ve tek koloniler için agar üzerine çizerek bir malt özü agar plakasının merkezine aktarın. Plakaları iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Steril bir uygulama çubuğu veya aşılama döngüsü kullanarak, koloniyi bir kez çizerek malt ekstrakt agar üzerine üretilen tek bir koloninin alt kültürü.
Hasat edilen sporları plakanın ortasına yayın. Kültür depolaması için Aspergillus fumigatus sporlarını veya miseliyi hasat etmek için steril% 30 gliserol çözeltisi hazırlayın. Agar plakalarının 37 santigrat derecede iki günlük inkübasyonundan sonra, bir pipet kullanarak% 30 gliserol çözeltisinin bir mililitresini aspire edin ve Aspergillus fumigatus kolonisine dağıtın.
Aspergillus fumigatus suşlarının fenotipik tanımlanması için, 990 mikrolitre suya eklemek üzere misel ve spor stoklarının 10 mikrolitresini aspire edin. Bu seyreltilmiş spor süspansiyonunu vorteks edin ve süspansiyonun 10 mikrolitresini standart bir mikroskop sürgüsüne dağıtın. Daha sonra 400X büyütmede bileşik bir mikroskop kullanarak süspansiyonu görüntüleyin ve konidioforları bulun.
Gözlenen konidiofor morfolojisini Aspergillus fumigatus conidiophore morfolojisi ile karşılaştırın. Dokuz mikro uydu lokusunun her biri için doğru parça boyutunu belirlemek için, parça analizi yapabilen bir yazılım kullanın. Kılcal elektroforezden elde edilen ham verileri alın ve parçalanmış analiz yazılımını kullanarak en büyük zirveye göre parça boyutlarını puanlayın.
Ardından, Af293 referans suşunun yinelenen sayılarının parça boyutlarını kullanan dokuz düşük kullanımın her biri için parça boyutlarını yinelenen sayılara dönüştürün. Dokuz ülkede 53 yerden toplanan 3.826 toprak örneğinden 1.473 maya suşu izole edildi. Her ülke için en iyi inkübasyon sıcaklığı, yıllık ortalama sıcaklığına göre belirlendi.
Her ülke için nadir görülen analizde, Shannon çeşitlilik indeksi toprak mayası çeşitliliğinin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Ortaya çıkan nadir eğriler, doygunluk asimptotuna yaklaştı ve ek örneklemenin daha fazla maya çeşitliliği sağlamasının muhtemel olmadığını gösterdi. Plakalardaki misel büyümesi, Aspergillus fumigatus'a özgü yeşil sallanan morfolojiyi oluşturdu.
Diğer termotoleranslı mantar türleri aynı toprak örneğinde bulunabilir ve Aspergillus fumigatus'u aynı plakada veya kendi başlarına yetiştirebilir. Işık mikroskobu kullanılarak görüntülenen ve tanımlanan Aspergillus fumigatus conidiophore yapısı, konidioforların çubuk morfolojisinde bir topa sahip olduğunu ve konidioforların tek serili olduğunu, burada konidia zincirlerine bağlı fiyalitlerin doğrudan küresel veziküle bağlandığını ortaya koymuştur. Biseriat tarafından üretilen bir kromatogram, Aspergillus fumigatus dinükleotid, trinükleotid ve tetranükleotid kısa tandem tekrarları lokuslarının fragman uzunluklarını görselleştiren üç kanalı ortaya çıkardı.
R komut dosyası plot_poppr_msn veya imsn kullanılarak yüksek kaliteli minimum yayılan bir ağ oluşturulabilir. Temel bileşenlerin ayrımcı bir analizi, suşlar arasındaki genetik ilişkileri görselleştirmek için başka bir yöntemdir. Büyüme ortamına benomil ve kloramfenikol eklenmesi, sırasıyla küf ve bakteri üremesini önler ve maya seçimini destekler.
Kloramfenikol ayrıca ortamdaki fermantasyonu azaltır ve kuluçka tüplerinde gaz birikmesini azaltır. Toprak örnekleri üzerinde metagenomik yapmak, kültürel çeşitlilik hakkında ek bilgi sağlayacaktır. A.fumigatus suşlarının duyarlı testleri, direnç genotiplerinin varlığını tanımlayacaktır.
Bu protokol diğer maya ve kalıp sistemlerine çok az değişiklikle uygulanabilir. Kültürel toprak mayası çeşitliliğinin ve öngörücülerinin küresel ölçekte araştırılmasını kolaylaştırdı.
