Nosso protocolo investiga a diversidade de leveduras e moldes no solo usando amostras de solo obtidas de diferentes regiões climáticas. Isso fornece insights sobre a diversidade ambiental da levedura e ajuda a rastrear espécies patogênicas. O protocolo oferece um método econômico e rápido de colheita de leveduras e mofo do solo.
As amostras de solo podem ser totalmente processadas para obter isolados em apenas sete dias. A configuração experimental bem organizada, como rotular tubos de cultura e preparar a mídia com um dia de antecedência, é a chave para evitar se sentir sobrecarregado durante o experimento. Comece com a preparação de um conjunto de tubos de cultura estéreis de 13 mililitros.
Rotulando-os com iD amostra de solo, em seguida, use uma pipeta sorológica para adicionar cinco mililitros de levedura extrato-peptone-dextrose caldo complementado com clorofenicol e benomil em cada tubo. Dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois, transfira aproximadamente 0,1 gramas de solo para o tubo de cultura apropriado usando um aplicador de ponta de couro de madeira estéril. Tampe o tubo com segurança para a primeira parada, evitando derramamentos enquanto permite a troca de ar durante a incubação.
Em seguida, incubar os tubos de cultura em um tambor de rolo por 24 horas a uma temperatura considerada ótima para maximizar o crescimento da levedura. Em seguida, rotule o clororamfenicol e o extrato de levedura suplementada de benomíl com placas de ágar com a identificação da amostra do solo antes de transferir o supernatante para o meio sólido. Remova os tubos de cultura do tambor de rolo.
Em seguida, dentro de um gabinete de biossegurança para organismos de nível dois, brevemente vórtice do tubo para desenhar partículas de solo e células que podem ter se estabelecido no fundo de volta à suspensão. Em seguida, transfira 100 microliters do supernatante para uma placa usando uma micropipette. Use um espalhador de células reutilizáveis estéreis para espalhar o líquido completamente e uniformemente sobre a superfície do ágar.
Depois de permitir tempo suficiente de incubação de dois a três dias, inspecione as placas para qualquer crescimento de levedura dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois. Procure por leveduras cremosas, redondas e foscas que podem ser facilmente distinguidas das colônias bacterianas e de moldes. Selecione uma colônia semelhante a um fermento de cada placa usando varas de aplicadora de madeira estéril.
Transfira cada colônia selecionada para um extrato de levedura fresco peptone-dextro agar placas complementadas com clororamfenicol e benomyl e listras para colônias únicas. Execute três raias separadas e use uma nova vara aplicadora para cada raia. Em seguida, use células frescas desenvolvidas em uma placa para realizar uma reação em cadeia de polimerase colônia.
Use esprizadores transcritos internos ITS1 e PRIMERs ITS4 para amplificar o gene de codificação da barra fúngica. Compare a sequência espacial transcrita interna obtida das cepas de levedura, duas sequências depositadas em bancos de dados públicos, como o National Center for Biotechnology Information GenBank e a UNITE para estabelecer a identidade das espécies. Adicione o solo a tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de caldo de dextrose Sabouraud e incubar a 50 graus Celsius por dois a quatro dias.
Transferir a micélia do caldo inoculado do solo para placas de ágar extrato de malte, primeiro, identificar os inóculos do solo que têm crescimento micelial visível adicionam o caldo de dextrose Sabouraud à fronteira de ar. Em seguida, use varas de aplicador de ponta de madeira esterilizada para transferir a micélia para o centro de uma placa de ágar extrato de malte e incubar estes extratos de malte ágais conjuntos 37 graus Celsius por três dias. Para a seleção da micélia, com propriedades morfológicas Aspergillus fumigatus, identifique as colônias de moldes que têm crescimento verde-influenciado característico.
Dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois, colhe conidia ou micélio raspando a superfície uma vez usando varas de aplicador de ponta de couro de madeira esterilizada ou um laço de inoculação e transferi-lo para o centro de uma placa de ágar extrato de malte, listrando-se sobre o ágar para colônias únicas. Incubar as placas a 37 graus Celsius por dois dias. Usando uma vara de aplicação estéril ou laço de inoculação, subcultura uma única colônia gerada em ágar extrato de malte, espalhando a colônia uma vez.
Espalhe os esporos colhidos no centro da placa. Prepare uma solução estéril de 30% de glicerol para colher os esporos de fumigatus Aspergillus ou micélio para armazenamento de cultura. Após os dois dias de incubação das placas de ágar a 37 graus Celsius, aspire um mililitro da solução de 30% glicerol usando uma pipeta e disperse-a para a colônia Aspergillus fumigatus.
Para identificação fenotípica das cepas Aspergillus fumigatus, aspire 10 microliters dos estoques de micélio e esporos para adicionar em 990 microliters de água. Vórtice esta suspensão diluída de esporos e dispensar 10 microlitros da suspensão em um slide de microscópio padrão. Em seguida, usando um microscópio composto na ampliação de 400X, visualize a suspensão e localize os conidioforos.
Compare a morfologia conidiophore observada com a morfologia aspergillus fumigatus conidiophore. Para determinar o tamanho correto do fragmento para cada um dos nove loci micro-satélites, use um software capaz de analisar fragmentos. Recupere os dados brutos obtidos da eletroforese capilar e ecore os tamanhos dos fragmentos com base no maior pico usando o software de análise fragmentado.
Em seguida, converta os tamanhos dos fragmentos em números repetidos para cada um dos nove baixos use os tamanhos de fragmento dos números repetidos da cepa de referência Af293. De 3.826 amostras de solo coletadas em 53 locais em nove países, 1.473 cepas de levedura foram isoladas. A melhor temperatura de incubação para cada país foi determinada com base em sua temperatura média anual.
Na análise de rarefação para cada país, o índice de diversidade de Shannon foi usado como medida da diversidade da levedura do solo. As curvas de rarefação resultantes se aproximaram da assíntota de saturação indicando que a amostragem adicional não teria rendido mais diversidade de leveduras. O crescimento micelial em placas formou a morfologia verde influenciada típica de Aspergillus fumigatus.
Outras espécies fúngicas termotolerantes podem estar presentes na mesma amostra de solo e cultivar o Aspergillus fumigatus na mesma placa ou por si mesmas. Aspergillus fumigatus conidiophore estrutura vista e identificada por meio de microscopia leve revelou que os conidioforos têm uma bola na morfologia da vara e os conidioforos são uniseriados, onde os fálios ligados às cadeias de conidia são anexados diretamente à vesícula esférica. Um biserinato gerado por cromograma revelou os três canais visualizando os comprimentos fragmentos de Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinucleotídeo e tetranucleotídeo curto tandem repete loci.
Uma rede de abrangência mínima de alta qualidade pode ser gerada usando o script R plot_poppr_msn ou imsn. Uma análise discriminatória dos componentes-princípio é outro método para visualizar as relações genéticas entre as cepas. Adicionar benomyl e clororamfenicol à mídia de crescimento impede o crescimento de mofo e bactérias, respectivamente, e favorece a seleção de leveduras.
O clorofenicol também reduz a fermentação na mídia, reduzindo o acúmulo de gás em tubos incubadores. A realização de metagenômicas em amostras de solo fornecerá informações adicionais sobre diversidade cultural. Testes suscetíveis de cepas de A.fumigatus identificarão a presença de genótipos de resistência.
Este protocolo pode ser aplicado a outros sistemas de leveduras e moldes com pouca modificação. Facilitou a investigação da diversidade cultural da levedura do solo e seus preditores em escala global.
