İntomopatojenik mantar izolasyonu yöntemi mikrobiyal kontrol ajanlarının geliştirilmesi için önemlidir. Bu protokol, toprak örneklerinden yüksek virülanslıentojenik mantar izolelerini izole etmek ve seçmek için kullanılabilir. Bu teknik, üç patojeniklik taraması prong içerir ve etkili konidia sayısı sıralamasını yapmak için termotolerans ve konidia üretim testini birleştirir.
Yöntem, ticarileştirme için yüksek virülans ve umut verici entomopatojenik yeni mantar izolelerinin seçilmesine yardımcı olabilir. Bu protokol biyolojik kontrole odaklanır, zararlılar ve entomopatojenik mantarlar arasındaki etkileşimi incelemek için entomopatojenik mantar izolelerini keşfetmek için de kullanılabilir. Prosedürü gösterenler Yao-Chia Liu ve nian-Tong Ni olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi.
Yüzey toprağının bir santimetresini çıkararak toprak örneğinin toplanmasıyla başlayın ve daha sonra toprağı bir kürek kullanarak her örnekleme alanından beş ila 10 santimetre derinlikte toplayın. Her örnekleme bölgesinin ayrıntılarını kaydettikten sonra, mantar izolasyon protokolünü üç saat içinde gerçekleştirmek için oda sıcaklığında 100 gram toprak örneğini plastik bir torbaya toplayın ve bakımını yaptı. Potansiyel entomopatojenik mantarları veya EPF'yi izole etmek için, plastik bir kaba 100 gram toprak örneği ekleyin ve larva mortalitesini ve mikozu günlük olarak gözlemleyerek ve kaydederek iki hafta boyunca karanlıkta oda sıcaklığında toprak yüzeyine beş Tenebrio molitor solucanı yerleştirin.
Ölü larvaları mantar izolasyonu için iki haftaya kadar bardakta tutun. İki hafta sonra, ölü böcekleri temiz bir banka aktarın ve konidia toplamak için steril bir kürdan kullanın. Birincil mantar kültürünü elde etmek için, toplanan konidiayı çeyrek mukavemetli sabouraud dekstroz agar orta veya SDA'da 55 milimetrelik bir plakada yedi gün boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Sekizinci günde, tek bir mantar kolonisi elde etmek için kültürü yedi gün boyunca 25 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce, her birincil kültür mantarını laminer akış davlumbazında 55 milimetrelik çeyrek mukavemetli bir SDA plakasına koyun. İlk patojeniklik taramasında, beş Tenebrio molitor larvasını doğrudan 25 santigrat derecede her saf mantar kültür plakasının yüzeyine yerleştirin. Mikozu ve mortaliteyi 10 gün boyunca gözlemledikten ve kaydettikten sonra, daha fazla analiz için mantar izolelerini seçin.
İkinci virülans testini yapmak için, her mantarın konidiasını bir dakika boyunca girdaplayarak hasat edin ve bir hemositometre kullanarak konidia sayısını sayın. Bittiğinde, konidia süspansiyonu, karanlıkta 25 santigrat derecede yedi gün boyunca büyümek için 55 milimetrelik çeyrek mukavemetli bir SDA plakasına 10 mikrolitre mantar süspansiyonu yaymadan önce, mililitre başına 1/7 konidia konsantrasyonuna% 0.03 yüzey aktif çözeltide bir kez 10 kez ayarlayın. Sekizinci gün, beş Tenebrio molitor larvasını doğrudan her saf mantar kültür plakasının yüzeyine yerleştirin ve plakaları daha önce açıklandığı gibi mikoz ve mortaliteyi gözlemlerken kuluçkaya yatmak için Parafilm filmi ile kapatın.
Her mantar izolesi için triplicate ikinci virülans testini tekrarladıktan sonra, Spodoptera litura gibi hedef haşere için üçüncü virülans testini gerçekleştirmek için izolatları seçin. Mantar genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak mantar genomik DNA'sını çıkarmak için yedi günlük çeyrek mukavemetli SDA plakasından yaklaşık bir milimetre kare EPF toplayın. Daha sonra, metin el yazmasında açıklanan PCR programını takiben DNA örneğinin PCR'si tarafından mantar iç transkriptli aralayıcıyı veya ITS bölgesini güçlendirin.
PCR ile güçlendirilmiş ürünü ticari sıralama hizmetiyle sıraya girdikten sonra, NCBI veritabanında benzer mantarları aramak ve filogenetik analiz için göreli mantar türlerini seçmek için NCBI BLAST'ı kullanın. Birden çok diziyi hizalayın ve korunmuş sıra bölgesini GeneDoc ile manuel olarak kırpın. Filogenetik analizi minimum evrime, komşu birleştirmeye ve maksimum olasılık yöntemlerine göre gerçekleştirin.
Mantarların morfolojisini incelemek için, mantar kültürü kolonisinin büyümesini bir kamera ile yedi gün boyunca yakalayın ve kolonilerin büyümesini, formunu: kabarık veya sıkı ve rengini kaydedin. Konidiayı konidioforesta gözlemlemek için, konidiayı bir aşı döngüsü ile saf kültür mantar kolonisinden kazıyın ve sporları% 0.1 Ara 80 çözeltisi içeren bir cam slayda aktarın. Mantar kolonisinin bir agar bloğunu kesmek için bir neşter kullanın ve ardından agar bloğunu cam bir slayda aktarın ve agar üzerindeki fazla konidiaların çoğunu yıkamak için% 0.1 Ara 80 çözeltisini ekleyin.
Daha sonra, konidianın hafif mikroskobik gözlemi için slaydı bir kapak kayması ile örtün. Farklı mantar izolatları arasındaki farkı karşılaştırmak için konidia ve konidiophores'un genişliğini ve uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Seçilen mantar izolatını 10 gün boyunca karanlıkta yaklaşık 25 santigrat derecede çeyrek mukavemetli SDA ortamında kült ederek bir konidial üretim tahlilini düzenleyin.
Daha sonra mantar izolatının bir mililitrelik konidial süspansiyonu% 0.03 yüzey aktif çözeltisinde hazırlayın ve ardından konsantrasyonu daha önce açıklandığı gibi mililitre başına 1/7 konidia'ya bir kez 10'a ayarlayın. Çeyrek mukavemetli bir SDA plakasına 10 mikrolitrelik konidial süspansiyondan oluşan üç damlacık ekledikten sonra, mantarların sporülasyonunu saymak için kültürü karanlıkta 25 santigrat derecede yedi, 10 ve 14 gün kuluçkaya bırakın. Her zaman noktasında, beş milimetrelik bir agar bloğunu bir mantar borer ile koloninin merkezinden ayırın ve bloğu% 0.03 yüzey aktif çözeltinin bir mililitresini içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Tüpü 15 dakika boyunca oda sıcaklığında dakikada 3.000 dönüşte girdapladıktan sonra, konidia sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Termotolerans tahlilleri için, seçilen mantarı izole edin ve daha önce gösterildiği gibi mililitre süspansiyon başına 1/7 konidia için bir kez 10 kez hazırlayın. Girdaptan sonra, konidial süspansiyonu kuru bir banyoda 45 santigrat derecede farklı zaman aralıkları için ısıtın.
Isıya maruz kalma sonrası, her zaman noktasında 55 milimetrelik çeyrek mukavemetli bir SDA plakasına beş mikrolitrelik konidial süspansiyondan üç damlacık ekleyin ve ardından plakaları 18 saat boyunca yaklaşık 25 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Çimlenme oranını belirlemek için, ışık mikroskobu altında rastgele seçilmiş beş alana sahip çimlenmiş konidia sporlarının sayısını 200 kat büyütme ile sayın. Formülü kullanarak toplam etkili konidia sayısını veya ECN'yi hesaplayın ve ardından makalenin tanımladığı gibi mantar suşlarının prensip bileşen analizini veya PCA'sını hesaplayın.
Hedef zararlıların virülans testini gerçekleştirmek için ECN veya PCA'ya dayalı en iyi performans gösteren mantar suşlarını seçin. İkinci virülans testinde, Tenebrio molitor yemek kurtlarına karşı 26 mantar izolatının virülansı değerlendirildi. Spodoptera litura'ya karşı virülans testi için patojenikliği yüksek 12 mantar izolat seçildi.
Mantar taksonomik pozisyonlarını daha iyi anlamak için, ilk patojenite taramasından 26 izolat ITS bölgesine dayalı moleküler analize tabi tutuldu. Mantar morfolojik gözlemlerinin temizleme yöntemi ile konidiophores yapıları% 0.1 Ara 80 çözelti ile net bir şekilde görülebilir. Konidia'nın rengi, şekli ve düzeni, konidia kolonisinin mikroskobik gözlemleri ile incelendi.
ECN, her EPF'nin konidia üretimi ve termotolerans verilerini birleştirir. ECN değeri yüksek olduğunda mantar suşunun yüksek canlılığı gözlendi. Ayrıca, PCA ve ECN arasındaki büyük koordinasyon ortaya çıktı ve ECN'nin uygulanabilirlik ile ilgili parametrelerin hiyerarşisini değerlendirmek için kullanılabileceğini öne sürdü.
Mantar DNA'sının çıkarılması ve mantar izolatının kült örülmesi prosedürde önemlidir. ECN hesaplama formülü kullanılarak ideal iç patojenik mantarlar seçilebilir. Toprak örneklerinden entomopatojenik mantarları yemlemek için daha büyük balmumu güvesi ve yemek kurdu gibi farklı böcek türlerinin kombinasyonu, entomopatojenik mantarların çeşitliliğini artırabilir.
Bu protokolün çalışması sırasında toprağın mikroorganizma çeşitliliği çok ilginç bir konudur. Bu protokolle gelecekte daha fazla araştırılabilir.
