Merhaba, ben Yangzhou Üniversitesi'nden Kai Jin. Araştırma grubumuz adına, gelişimsel araştırmalarda tavuk embriyosunun güçlü bir aracını sunacağım. Tavuk embriyosu, gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılan klasik bir gelişim modelidir, aslında, laboratuvarın tavuk embriyolarına yönelik yabancı önlemleri, gen transfeksiyonu, transgenik ıslah ve gonadal transmural preparat gibi gelişimsel biyoloji için değerli bir araçtır.
Laboratuvarımızda mu-tipi enjeksiyon yöntemlerini belirledik, ancak birçok araştırmacı için enjeksiyonun detayı belirsiz ve çizgilenmesi zor. Bu nedenle, bu videoda, ovo'daki tavuk embriyosu gelişiminin erken aşamasında vasküler enjeksiyonun ayrıntılarını göstereceğiz. İlgileniyorsanız bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin.
Burada, protokolün ayrıntılarını gösteriyoruz. Döllenmiş yumurta toplama ve hazırlama. İlk olarak, memelilerin aksine, tavuğun tek bir yumurtalıkta milyonlarca folikülü vardır, ancak bu foliküllerin sadece birkaçı yumurtlamak için yeterince olgundur.
Her folikül bir yumurta veya germ hücresi içerir. Folikül olgunlaşır olgunlaşmaz ve sarısını serbest bırakır bırakmaz, fallop tüpünün hunisine dahil edilir. Folikül yumurta kanalının juguler karnına girdiğinde, meni tavuğun vücudundaki yumurtaya bağlanır ve tavuğun vücudundaki kalsiyum, döllenmiş yumurtayı saran ve vücutta yumuşak bir kabuk yumurta oluşturan bir kabuk oluşturur.
Kalsiyum kabukları, yumurta üretilene kadar yavaş yavaş kalınlaşır. Akademik olarak embriyo yumurtaları olarak adlandırılan döllenmiş yumurtayı toplayın ve bunları 37.8 santigrat derece ve% 60 nemde bir inkübatördeki bir rafa düzgünce yerleştirin. Embriyolar uygun koşullar altında inkübe edilir.
İki günlük inkübasyonlardan sonra, ilkel kalpler adı verilen küçük titreşen kırmızı noktalar ortaya çıkar. Bu işleme kiraz dövme denir. Yaklaşık 2,5 günde, kan damarları görülebilir ve kalp ve vücut segmentleri oluşmuştur.
İğne ve plazmid hazırlanması. Cam kılcal damarları iğne olarak kullanıyoruz. Enjeksiyondan önce, dış çapı bir milimetre ve iç çapı 0,6 milimetre olan cam kılcal damarlar hazırlayın.
Eksojen materyaller genellikle plazmidler, paketlenmiş lentivirüsler ve ilkel germ hücreleri veya PGC'lerdir. Bu videoda, enjekte edilen malzemelerin izini göstermek için tripan mavisini kullanıyoruz. Pencereleme. Embriyoları açığa çıkarmadan önce, mikrop kontaminasyonunu önlemek için embriyoları sterilize etmemiz gerekir.
Bu, embriyoların yüzeyinin yumurta açıklığı bölgesinde% 75'lik bir alkol pamuk topu ile hafifçe silinmesiyle yapılır. Dezenfeksiyondan sonra, yumurta kabuğunun künt ucuna forseps ile hafifçe dokunun ve embriyoyu ortaya çıkarmak için forseps ile yumurta kabuğunun yüzeyinde 0,5 santimetre x 0,5 santimetrelik bir deliği dikkatlice kırpın. İnovo-intravasküler enjeksiyon.
Mikroskop altındaki görünüme bakın, önce embriyoyu bulmak için mikroskopun odağını ayarlayın ve ardından tavuk embriyosunun kan damarlarını enjeksiyona hazır bulun. İğneyi eksojen madde ile kan damarına hedefleyin, iğnenin enjekte edilen kan damarına paralel olduğunu unutmayın. İğneyi yavaşça kan damarına yerleştirin ve ardından hava pompasını açın.
Bu noktada, yabancı madde artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte, arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner. İki tip vasküler enjeksiyon vardır. Birincisi, yabancı maddenin embriyonun başındaki bir damardan enjekte edildiği ve kalbe geri aktığı bir kafa enjeksiyonudur.
Diğeri ise yabancı maddenin kalbin atmasıyla embriyoya dolaştığı dorsal aort enjeksiyonudur. Embriyonik kalbin atması ve kan dolaşımı ile yabancı maddenin arterin sonundaki kılcal damarlar tarafından damar içine alındığını ve daha sonra damardan embriyoya geri döndüğünü açıkça görebiliriz, bu da enjekte edilen yabancı maddenin embriyonun her bir bölümüne etkili bir şekilde verildiğini gösterir. Enjeksiyondan sonra, yumurtayı stereomikroskoptan çıkarın, küçük makasla üç santimetre uzunluğunda bir tıbbi bant parçasını kesin ve bandı açıklığa takın.
Herhangi bir hava kabarcığını sıkmak için bandı makasla yavaşça kazıyın ve ardından açıklığı bir haç içine kapatmak için başka bir bant parçasını kesin. Açıklığı kapattıktan sonra, enjekte edilen embriyolar dikkatlice inkübatöre geri yerleştirilir. Burada enjeksiyon sonrası tavuk embriyolarının temsili görüntülerini gösteriyoruz.
İlk görüntü lentivirüs plazmid enjeksiyonunun sonucunu göstermektedir. Stereoskopik floresan mikroskobu altındaki yeşil floresan, embriyolarda enjekte edilen plazmidin başarılı bir şekilde ekspresyonunu gösterir. Bu, plazmidlerin tavuk embriyolarına intravasküler enjeksiyonunun fizibilitesini göstermektedir.
İkinci görüntü PGC enjeksiyonunun sonuçlarını göstermektedir. PGC'ler RFP ile etiketlendi. Bu resimde, alıcıların gonadında bulunan kırmızı noktalar olan enjekte edilen PGC'leri görebiliyorduk.
Bu, donör PGC'lerin alıcıların gonadına etkili bir şekilde girebildiğini ve kolonize edebildiğini göstermektedir. Sonuç olarak, bu protokol eksojen materyallerin, plazmidlerin veya PGC'lerin tavuk embriyolarına in-ovo intravasküler enjeksiyonu işlemini sunmaktadır. Burada gösterilen yöntemin takip edilmesi ve öğrenilmesi kolaydır ve birçok alanda uygulamaya değer.
Sizinle paylaşmak istediğim tek şey bu. Umarım bu yaklaşım, tavuk embriyolarının ve gelişim biyolojisinin belirlenmesinde güçlü bir araştırma aracı olarak çalışmanızı kolaylaştırır. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz ve araştırmanızda iyi şanslar.
