Drs&#39;a teşekkür etmek isteriz. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria ve Bayan Ximena Optiz-Araya, protokol kurulumu ile ilk yardım için ve plazmid sağlamak için. Bu çalışma NIH / NIDCD hibe DC013841 (JTS) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberleri Ulusal Enstitüleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1. Yumurta Taşıma <ol><li> Gübrelenmiş yumurtaları yerel bir satıcıdan satın alın. Kuluçka öncesi en fazla 5 gün boyunca yumurtaları 13 ° C&#39;de bir buzdolabında saklayın. Embriyo canlılığı, 1 hafta sonra belirgin şekilde azalır. </li><li> Kuluçka makinesi koymadan önce her yumurta% 70 etanol ile sürün. </li><li> Yaklaşık% 50 nemde sıcaklık 38 ° C&#39;ye ayarlanmış bir inkübatörde 1-2 düzine yumurta koyun. Bu, sırasıyla, elektroporasyon ve uygun canlılık için uygun embriyo konumlandırma sağlar. NOT: 48-52 saat kuluçkadan sonra, yumurtalar ~ 12-13 Hamburger-Hamilton (HH) evresinde olacak ve elektroporasyon için hazır olacaktır. </li></ol> 2. Hazırlık <ol><li> Mi plazmasıxing <ol><li> Her 7 mcL DNA karışımı için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (18 MΩ deiyonize ve damıtılmış H2O [ddH2O] içinde% 0.1) ilave edin. </li><li> Birden çok plazmitin birlikte elektroporasyonu için plazmidleri 1: 1 oranında karıştırın. Nihai DNA konsantrasyonu 5-8 μg / μL olmalıdır. </li></ol></li><li> Dolgu Enjeksiyonlu Pipet <ol><li> Bir mikropipet çekicide pipetleri çekin. Bir 28G şırınga iğnesi kullanarak 1-2 mcL plazmid pipet doldurun. </li><li> Forsep kullanarak pipet ucunu 10 - 20 μm&#39;ye kadar kesin. Kırılmış pipet ucunun boyutunu belirlemenize yardımcı olması için bir mikroskop kullanın. Pikspiritör pipet tutucusuna pipet takın. </li></ol></li></ol> 3. Pencereleme NOT: Pencereleme prosedürü 13&#39;ten önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen referans 13&#39;e bakınız. <ol><li> Tüm malzemeleri ve çalışma alanını% 70etanol. </li><li> Kuluçka makinesinden istenilen sayıda yumurta alın (6-10 arası), oda sıcaklığında bırakın ve ayrı ayrı% 70 etanol içeren yumurtaları sürün. Kuluçka makinesinin çıkartılmasından sonra yumurtalar en az 2 saat süreyle canlı kalır. </li><li> Embriyo konumlandırmayı tanımlamak için yumurtayı hafif bir aydınlatıcının üzerine yerleştirin. Karanlık bölgenin merkezini ( yani embriyo) bir kurşun kalemle daire haline getirin. </li><li> Bir 19G iğne kullanarak, yumurtanın künt ucundaki bir delik açın. </li><li> Yumurtanın sivri tarafındaki çizilmiş çemberin yakınındaki bir başka delik açın. 19G iğne ile dış yumurta kabı (yaklaşık 16 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın ve sonra forseps ile iç yumurta kabuğunun (yaklaşık 8 mm 2 ) küçük bir parça çıkarın. </li><li> 19G&#39;lik bir iğne takılmış 3 mL şırınga ile yumurtadan künt uç deliğinden 1.5-2.5 mL albümini geri çekin. İğneyi 45 ° açıyla aşağıya açtığınızdan emin olun. </li><li> Kör uç deliğini küçük bir bant parçası (1 cm x 1 cm) ile örtün. Çizilen daireyi veD ikinci deliğin bantla (2.5 cm x 4 cm). </li><li> Kıvrımlı makas (kesme kenarı = 2.5 cm) ile, bir pencereyi daire içinde kesin. Makas yumurta kabuğuna paralel olmalıdır ve pencerenin çapı 2 cm&#39;den az olmalıdır. </li></ol> 4. Plasmid Enjeksiyonu <ol><li> Pikristin cihazını açın. Basıncı 18 psi ve süresi 5 μs olarak ayarlayın. Diseksiyon mikroskopu için hava tankını ve lambayı açın. </li><li> Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karışık bir mağaza satın Hint mürekkebi 1: 10 seyreltme 30 ml stok solüsyonu olun. 4 ° C&#39;de saklayın. Hint mürekkebinin enjeksiyonu, tavuk embriyonunun daha iyi görselleştirilmesi için önemli bir adımdır. <ol><li> Seyreltilmiş Hint mürekkebi çözeltisi ile 1 mL şırınga doldurun. 27G&#39;lik bir iğne takın ve şırıngadaki mevcut kabarcığı dışarı atın. </li><li> Embriyonun 2-3 mm kadar solüsyonunu hemen sarısı membranın altına yerleştirin ve ~ 0.2 mL Hint mürekkebi yavaşça embriyo altına enjekte edin. YapEmbriyonun sağkalımını azaltabileceğinden, Hint mürekkebinin 0.5 mL&#39;den daha fazla enjekte edilmemelidir. </li></ol></li><li> Pencere yumurta diseksiyon mikroskopu altında bir yumurta tutucu yerleştirin. Plazmid enjeksiyon bölgesinin en iyi görselleştirilmesi için en yüksek büyütmeyi kullanın. </li><li> Forseps kullanarak membranı enjeksiyon bölgesi üzerinden çıkarın. Dikkat çekici işitsel beyin sapı bölgeleri ( ör . NM ve NL) Rhombomeres 5 ve 6&#39;dan (R5 / R6) ortaya çıkar. R5 / R6, R5 / R6 plasmid enjeksiyonları için yer işaretleri olarak görev yapan otokistlere (omurgalılarda embriyonik yapı, iç kulağa doğru gelişir) bitişik olarak bulunur. </li><li> DNA dolgulu pipeti, R5 / R6 bölgesini örten sinir tüpüne ve mikromanipülatörü kullanarak otokistler arasına indirin. Şekil 1A&#39;da ideal yerleşim şeması gösterilmektedir. </li><li> Sinir tüpünde DNA çıkarmak için pikspritzerden hava basıncı (18 psi, 5 μs süre) uygulayın. </li></ol> 5. Elektroporasyon <ol><li> Aç şunuO akım / voltaj uyarıcısı. </li><li> PBS ile 3 mL enjektör doldurun ve şırınga filtresini takın. Embriyo üzerine 1-2 damla PBS ekleyin. </li><li> Enjeksiyon yerinin üstünde negatif elektrot (medial) ve R5 / R6&#39;ya ( Şekil 1A ) yan tarafta bulunan pozitif elektrot ile mikromanipülatörü kullanarak bipolar elektrodu embriyoya indirin. Embriyo ile doğrudan temastan kaçının. Elektrot malzemesinin platinyum iridyum olduğu yerde iki kutuplu elektrot kullanın. İpuçları arasındaki boşluğu forseps ile 0,5 mm&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bir akım / voltaj uyarıcısı kullanarak, 1 sn aralıklarla 1 ms için 50 V&#39;de 20 kez darbe uygulayın. </li><li> Elektroporasyondan sonra, maruz kalan alanın üzerine bir damla PBS ekleyin. Nazikçe elektrodu çıkarın ve bir laboratuvar dokusu ve% 70 etanol ile temizleyin. Bez ile embriyo ortaya pencere kapatın. </li><li> Enjekte edilen plasmid tipi ve kuluçka tarihi ile yumurta kabuğunu etiketleyin. </li><li> Pencereyi yukarı gelecek şekilde yumurtaları kuluçka makinesine yerleştirin. 38 ° C&#39;de 50 ° C&#39;de inkübe edinİstenen gelişim aşamasına gelene kadar nem%. </li><li> Bir tet-on vektörü, gen ekspresyonunun zamansal kontrolü için elektroporasyona tabi tutulursa, gen ekspresyonunu başlatmak için 24 saatte bir Doxycycline (Dox) uygulayın (bkz. Bölüm 6). </li></ol> 6. Gen İfadesinin Zamansal Kontrolü için Tet-On Sistemi <ol><li> Aşağıdaki plazmidleri kullanın: PCAGGS-T2TP: bir transposaz ifade eden plasmid. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: Dox bağlayıcı proteini istikrarlı bir şekilde ifade eden bir plazmid. PT2K-BI-TRE-EGFP: EGFP raportörünün ve ilgili ikinci bir genin çift yönlü tet-on promotörünü (TRE) tetikleyen ekspresyonunu içeren bir plazmid. NOT: Yukarıdaki üç plasmidin 1: 1: 1 oranla birlikte elektroporasyona tabi tutulması gerekir. </li><li> Stok çözeltisi hazırlama: <ol><li> 1 mg / mL stok çözeltisi üretmek için Dox steril PBS&#39;de eritilir. -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Dox uygulaması: <ol><li> Ekspiroyu teşvik etmekBelirli gelişim evreleri boyunca ilgilenilen genin n&#39;si Dox&#39;u 24 saatte bir uygulayın. </li><li> Dox uygularken, yumurtayı çıkarın, pencereyi açın, 50 uL Dox&#39;u koryoarotomatik zara pipetleyin, pencereyi kapatın ve kuluçka makinesine yumurtayı geri koyun. </li></ol></li></ol> 7. Beyin Fırtınası Dilimleri İçin Diseksiyon Alanının Hazırlanması NOT: Aşağıdaki bölümler (7 - 9) ve prosedürler 14&#39;den önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen bu referanslara bakın. <ol><li> Bir agar solüsyonu hazırlayın (40 mg / mL agaroz, yani % 4 ddH20). Agar solüsyonunu bir Petri kabına dökün ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Dokunun beyin sapı dilimlemesi sırasında gelecekte kullanılmak üzere kapalı agar plakasını buzdolabında saklayın. </li><li> Yapay serebral omurga sıvısı (ACSF)% 95 O 2 ve% 5 CO 2 (pH 7.2-7.4 ve ozmolarite: 295-310 mOsm / L) sürekli kabarcıklar.</li><li> Çalışma alanını ve vibratomu% 70 EtOH ile temizleyin ve bıçağı damıtılmış su ile durulayın. </li><li> Uygun diseksiyon aletleri ile çalışma alanına temiz bir sıvı emici ped koyun. </li><li> Agar plakasını buzdolabından alın, küçük bir agar küveti kesin (10 mm x 10 mm x 8 mm). Ticari olarak mevcut superglue kullanarak bir vibratome dilimleme odasının aşamasına agar blok Tutkal. </li></ol> 8. Tavuk İşitsel Beyin Fırtınasının İzolasyonu <ol><li> Yumurtayı bantlanmış pencere alanından açın. Membran kese bir neşter ile delin ve tavuk embriyo başını çıkarın. </li><li> Tavuğu keskin makasla kes. </li><li> Tıraş bıçağı ucunu gözlerin arkasından hafifçe yerleştirin. Kafatası ile kaudal orta çizgide kafatası yoluyla incise edin. Embriyonun yaşına bağlı olarak hafif basınç uygulayın. Eski embriyolar daha fazla baskı gerektirir. </li><li> Kafatasını ortaya çıkarmak ve orta hat kesimini doğrulamak için yavaşça cildi ve tüyleri itin. </li><li> UygulanıyorTrunk basıncında, kafatasının rostral bölümünü bir ustura bıçağı ile kes. Bıçağı hemen gözlerin arkasına yerleştirin ve tüm kafatası ve beyin dokusunu kesin. </li><li> Başın iki yanındaki boyun kaslarının biraz önündeki, kafatasının kaudal bölgesindeki makasla orta hattan insana insizyon yapın.Kafatasını ve fazla dokuyu çekerek beyin ve beyinciği açığa çıkarın. </li><li> Makasla beyin sapına yapışmış dokuyu kesin ve kafatasından rahatça ayıran beyin sapını çıkarın. </li></ol> 9. İnvivo Elektrofizyoloji veya Görüntüleme için Beyin Fırtınası Dilimlerinin Hazırlanması <ol><li> Beyin sapını optik tectadan geçirin. </li><li> Serebellumu, dördüncü ventrikülün zemini açığa vurarak, makaslarla pedankülleri keserek çıkarın. </li><li> Cımbız kullanarak, membranöz doku ve kan damarlarını beyin sapı yüzeyinden çıkarın. </li><li> Beyin kökeneğini engellemek için, dört katın en rostral ucunda yatay bir kesim yapınKortekste sadece kaudal olan ventrikül. Beyin sapını izole etmek için optik tecta lateral kesikler dikey yapın. </li><li> Agar bloğunun hemen önündeki vibratome sahnesine az miktarda süper tutkal yerleştirin. </li><li> Cımbız kullanarak omurgadaki beyin sapını kaldırın ve rostral yüzü aşağı bakan ve dorsal tarafı vibratome bıçağına doğru tutturun. Fazla tutkal bir laboratuvar dokusu veya filtre kağıdı ile çıkarın. </li><li> Vibrasyonlu sahneye oksijenli ACSF dökün. Vibrasyonlu bıçağı 20-22 ° açı ile ayarlayın. Maksimum genlik salınımında vibratome başlatın. Sahneyi bıçağa doğru yukarı hareket ettirin, böylece dokunun üst kısmı bıçakla paraleldir. </li><li> Bıçağı beyin sapı dokusuna doğru hızla hareket ettirin. Bıçağın doku ile temasından önce bıçağı yavaşça yavaşlatın. </li><li> Doku mümkün olan en yavaş ilerleme hızıyla kes. Bıçak tüm koronal doku bölümünden geçtikten sonra, bir transfer pipetini kullanarak dilimi hafifçe çıkarın. &lt;/ Li&gt; <li> Aşamayı 200-300 μm altına indirin ve tekrar dilimleyin. İşitsel çekirdeklerin anatomik işaretleri görünene kadar tekrarlayın; örneğin, NL&#39;nin belirgin dorsal / ventral nöropil bölgesi ve NM&#39;nin NL&#39;ye göre medial konumu. </li><li> ACFS&#39;de dilimleri dikkatlice muhafaza edin. Bu oda sıcaklığında (22 ° C) veya fizyolojik koşulların (~ 41 ° C) sıcak su banyosu kullanılarak yapılabilir. Dilimleme sırasına dikkat edin. İlk dilim en kaudal doku bölgesine karşılık gelir ve son dilim en rostral bölgeye karşılık gelir. Bu kabaca sırasıyla düşük frekanslı frekans bölgelerinden yüksek frekanslı kodlama bölgelerine yapılan işitsel beyin sapının tonotopik organizasyonunu temsil eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+time+coding+systems.">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li><li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system.">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ovo elektroporasyonunda in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri eksprese eden veya yere seren bir yöntem 8 , 9 . Tavuk embriyosunda plazmid kodlu genleri farklı işitsel beyin sapı bölgelerinde ifade etmek için yenilikçi bir yöntem 8 . Optimal ifade sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, yalnızca otokistleri açıkça görülen embriyolar enjekte edin. Otokistler görünür...

Sesin hızlı sinirsel kodlaması normal işitme işlevleri için gereklidir. Bunlar arasında ses lokalizasyon yetenekleri 1 , gürültü ayırımı 2&#39;deki konuşma ve davranışsal olarak diğer iletişim sinyallerinin anlaşılması 3 bulunur . Hem kuşların hem de memelilerin işitsel beyin sapında bulunan benzer nöronlar, hızlı sinirsel kodlama 4 için son derece uzmanlaşmıştır. Tavuk çekirdeği magnocellularis (NM), çekirdek laminaris (NL) ve bunların memeli analogları, anteroventral koklear çekirdek (AVCN) ve sırasıyla medial superior zeytin (MSO) 5 içerir . Bununla birlikte, hızlı sinirsel kodlamayı düzenleyen gelişim mekanizmaları, işitsel beyin sapında çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, hızlı inal kodlamadan sorumlu belirli genleri au&#39;da ifade, düzenleme ve işlevlerini daha iyi anlamak için incelemek avantajlıdırDitory gelişme. Gelişmekte olan tavuk embriyo, işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik sorularını incelemek için etkili ve köklü bir araştırma aracıdır 6 , 7 . Son moleküler ilerlemeler, gelişmekte olan tavuk embriyosundaki bu biyolojik soruları , in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri çürüterek veya çürüterek ele almıştır 8,9 . Spesifik genlerin düzenleyici rolünün araştırılması, işitsel açıklarla ilişkili patolojilerin anlaşılmasında önemli bir gelişmedir. Burada, plazmid kodlu genlerin, hızlı nöral ses kodlamasının gerçekleştiği tavuk işitme beyin sapı içine ovo elektroporasyonunda sunuyoruz. 5 ve 6 no.lu rhombomeres 11 , 12 ile birlikte görülen işitsel sinirsel progenitör bölgeleri hedef alarak (R5 /R6), biz NM ve NL plazmid transfeksiyon mekansal kontrol göstermektedir. Buna ek olarak, bir tet-on vektör sistemi benimseyerek ifadenin zamansal düzenlenişini gösteriyoruz. Bu, doksisiklinin (Dox) 8 varlığında ilgilenen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür.

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Elektroporasyon, genleri tavuk embriyo gibi biyolojik açıdan önemli organizmalara tanıtan bir yöntemdir. Tavuk embriyonunun işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik işlevlerini incelemek için etkili bir araştırma modeli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, tavuk embriyo, işitme ile ilişkili gen ekspresyonu, düzenlenmesi ve işlevinin incelenmesinde özellikle değerli hale geldi. Ovo elektroporasyonu, son derece uzmanlaşmış işitme işlevlerinden sorumlu işitsel beyin sapı bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Bu bölgeler tavuk çekirdeği magnocellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) içerir. NM ve NL nöronları rhombomerlerin 5 ve 6 (R5 / R6) &#39;nın belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bu bölgelerdeki gen ile ilgili özellikleri incelemek için plasmidle kodlanmış genlerin ovo elektroporasyonunda sunuluyoruz. Fonksiyonel fenotipin kazanılmasını veya kaybedilmesini teşvik eden, gen ifadesinin mekânsal ve zamansal kontrolü için bir yöntem gösteriyoruzes. R5 / R6 ile ilişkili işitsel nöral progenitör bölgeleri hedefleyerek, NM ve NL&#39;de plazmid transfeksiyonunu gösteririz. Gen ekspresyonunun zamansal regülasyonu bir tet-on vektör sistemi benimseyerek başarılabilir. Bu, doksisiklinin (Dox) varlığında ilgilenilen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür. İn ovo elektroporasyon tekniği - ya biyokimyasal, farmakolojik ve / veya in vivo fonksiyonel testlerle - birlikte, işitsel nöron gelişimini ve buna bağlı patofizyolojik olayları incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Ovo elektroporasyonunda normal olarak gelişen bir biyolojik sistemde gen ifadesine izin verdiğini burada gösteriyoruz. Plasmid ile kodlanmış genler, R5 / R6 üzerinde bulunan sinir tüpüne fokal olarak enjekte edilir. Önemli anatomik belirteçlere göre elektrod ve pipet yerleşimlerinin şematik bir örneği Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. Plazmid enjeksiyonunun doğru konumu, elektroporasyondan 24 saat sonra doğrulanır ve Şekil 1B&#39;de</...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K Görüntüleme.  Northwestern University.  Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz. 

Video: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

Tavuk İşitsel Beyin Sapı Dilimleri hazırlanması ve Kültür

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Nörobilim

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biyoloji

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

Tonotopik gradyanları ve mikrodevreleri değerlendirmek için embriyonik tavuk işitsel beyin sapının dilimlenmesi

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

Tavuk Yavrularında İşitsel Beyin Sapı Yanıtının Değerlendirilmesi

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler