The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Bu protokol &quot;vizyonu ve Oftalmoloji araştırma Derneği Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu&quot; nda tavsiyeleri doğrultusunda yapılır. 1. Yumurta Taşıma ve Göz koleksiyonu <ol><li> 1 hafta daha uzun süre 12-14 ° C&#39;de beyaz Livorno yumurta saklayın. Varsa, döllenmiş yumurta saklamak için buzdolabında şarap soğutucu kullanın. Not: düşük sıcaklıklar mortaliteyi artırırken yüksek mağaza sıcaklıkları, embriyo anormal gelişmesine yol açar. Genişletilmiş depolama süresi, mortalite ve anormal gelişimi hem de artırır. </li><li> Yumuşak, 24 saat başına 5 kez sıklıkta sallanan bir 37.5 ° C ve% 60 yumurta nemlendirilmiş kuluçka inkübe edin. </li><li> İstenilen embriyonik yaşta yumurta inkübatör kuluçkaya yumurta çıkarın. Not: Tavuk embriyo yaşı fırınlama süresi olarak belirlenir ve embriyonik gün (E) ya da aşamaları olarak ifade edilmektedir (st), Hamburger ve Hamilton 12 tarafından açıklanan gelişim evrelerinin serilere göre. </li><li> Laminer akış kaputu seçilen yumurta yerleştirin. Embriyonun kirlenmesini önlemek için% 70 etanol ile yumurta kabuğu silin. Not: Steril çözümleri ile aseptik şartlarda tüm işlemleri yürütmek <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> ve aletleri. </li><li> Yumurta açık çatlamak sıkıca sert bir yüzeye karşı yumurtanın yan dokunun. 100 mm Petri kabındaki içeriği yerleştirin. Kurumasını önlemek için doku önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS içeren 35 mm Petri kabı embriyo transferi için küçük bir kaşık kullanın. </li><li> Laminer akış kaputu bir binoküler mikroskop stereovision üzerine embriyonik doku içeren 35 mm Petri kabı yerleştirin. Ince forseps ile boyun sıkıştırarak embriyo başını kesmek ve vücudu atın. </li><li> Inci bir kesi yapmak için ince forseps kullanınGöze ventral kaba ağız. Kesi yerinde başlayan, tüm göz çevreleyen doku yırtarak açın. Optik siniri çimdik ve göz prizden sağlam gözü kaldırın. Kontrol veya tedavi göz ya da kullanım için aynı embriyodan sol ve sağ göz hem de toplayın. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1 x PBS içeren yeni bir 35 mm Petri kabı gözleri aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. </li></ol> Tüm Retina Eksplantlarından 2. Hazırlık <ol><li> Skleral anlage dahil gözün çevresindeki tüm doku kaldırmak için ince forseps kullanın. Not: Doku kolayca pigment epiteli bozulmamış (Şekil 1A-B) ile vitreus ve retina mercek üzerinde bırakarak ayırmak olacaktır. </li><li> Nöral retina (Şekil 1C) zarar vermeden, gözün dorsal kısmında pigment epiteli içine küçük bir kesi tutam ince forseps kullanın. </li><li> Yavaşça pigment epitel starti açmak gözyaşı ince forseps kullanın, kesi yerinde ng lens ve vitreus (Şekil 1D) bağlı tüm retina bırakarak. Pigment epitelinin çıkarılmasını kolaylaştırmak için sıcak (37 ° C) 1 x PBS içinde göz tutun. Pigment epitel, gözün ön bölgesinde, öğrenci etrafında siliyer cisim boyunca, özellikle çıkarılması zor olabilir ve koroid fissür boyunca Not:. Bu nedenle, pigment epitel bazı nöral retina (Şekil 1E-F) bırakılabilir. </li></ol> Tüm Retina Eksplantlarından 3. Tedavi <ol start="1"><li> Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon Not: Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon aşama 2&#39;de hemen sonra gerçekleştirilebilir. <ol><li> 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> 1.5 ml tek kullanımlık plastik küvetini kesti (12.5 mm x 12.5 mm x 45 mm) (ya da ince bir testere kullanmak sureti alttan olarak) yaklaşık 8 mm 300-400 ul çözelti tutma kapasitesine sahip herhangi bir küçük kap. </li><li> 0.1 ug / ul son konsantrasyon 1xDPBS tercih edilen bir DNA plazmidi seyreltilir. </li><li> ST20 için 15 V Electroporator ve ayarlanan parametreler açın - ST25 (E3-E4) retina ve st26 20 V - st27 (E5) retinanın. 1 sn aralıklarla 50 msn darbe uzunluğu 5 darbeleri darbe tekrarlar ayarlayın. Her iki elin yerine Elektrotları tutmak için gerekli olacak şekilde kat bir ayak pedalı, edilebilir bir puls jeneratörü kullanın. </li><li> İki kürek biçimli (düz, yuvarlak diam. 4 mm) bağlayın platin elektrotlar (Şekil 2A) puls üreteci üzerine çıkış soketine. Not: Bu protokolde kullanılan platin elektrot üniversite atölyesi tarafından yapılmıştır. Elektrotlar 0.1 mm platin plak &quot;rondelles&quot; (: 950 Pt / 5 Cu platin notu) yapılmıştır. Bağlanma 0,8 mm wiyeniden plastik boru kullanılarak izole edilmiştir. </li><li> Dikkatle retina eksplant için doğru ucu açılma boyutunu elde etmek kesilmiş ucu ile bir polietilen Pasteur pipeti kullanarak küvete (veya eşdeğer küçük kap) Adım 2.3 kadar tüm retina eksplant aktarın. Retina plastik eklemek ve parçalıyorlar eğilimi pipet uçları kullanmaktan kaçının. </li><li> Yavaşça yırtılmasını önlemek için retina dokunmamaya retina eksplant özen çevreleyen tüm 1x PBS kaldırmak için 100 ul pipet kullanın. </li><li> Bütün retina eksplant kapsayacak şekilde küvete 100 ul plazma çözeltisi ekleyin. O üstüne yüzen eğer hafifçe forseps ile retina eksplant aşağıya doğru bastırın. Küvete altına beher ve optik sinir herhangi bir tarafı yüz merceği için forseps veya elektrotlar kullanın. </li><li> Doku dokunmadan, lens ve retina (Şekil 2A) arkasına negatif elektrodun karşısında pozitif elektrot yerleştirin. </li><li>Ayak pedalına basarak akımı uygulayın. Başarılı akıntı belirten elektrotlarda baloncuklar için kontrol edin. </li><li> Retina zarar vermeden küvetin tüm plazmid karışımı kaldırmak için 100 ul pipet kullanın. Plazmid karışımı üç beş kez tekrar edilebilir. </li><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C) 1x PBS ile küveti doldurun. Yavaşça küvetin duvardan retina eksplant ayırmak için forseps kullanabilir. Elektroporasyondan sonra retina bazen küvetin çeperine bağlı yapan, kabarcıkları ile kaplıdır. </li><li> Oyuk başına 1 mi, önceden ısıtılmış (37 ° C) ihtiva eden bir kültür ortamı, 24 oyuklu bir plaka içine bütün retinal eksplant aktarmak için polietilen bir Pasteur pipeti kullanarak. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin. </li><li> 24 saat boyunca% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm&#39;lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de retina eksplant inkübe edin. Rotasyon orta ve Preve için maksimum etkiyi sağlamak için24 oyuklu plakanın alt retinanın nt yapışır. </li><li> 4. adıma geçin. </li></ol></li><li> Kimyasal reaktifler ile bütün retinal eksplantlar tedavisi Not: Bütün retina eksplantlar kimyasal işleme aşamasının 2 hemen sonra gerçekleştirilebilir. <ol><li> 1 DMEM: F12 Besin karışımı,% 10 FBS, 10 U / ml penisilin streptomisin, 5 ug / ml insülin, 2 mM L-glutamin ihtiva eden 1 kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Oyuk başına (37 ° C) kültür ortamı önceden ısıtılmış 1 ml ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka içine adım 2.3 retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Kuyu başına bir retina eksplant inkübe edin. </li><li> Kimyasal reaktif veya aracına ilave edilmeden önce% 5 CO2 ile bir hücre kuluçka makinesi içinde, 50 rpm&#39;lik sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de 60 dakika boyunca, tüm retina eksplant inkübe edin. </li><li> Örneğin, kimyasal çözelti hazırlayın Cdk1 / 2 inhibitörü III, nihai olarak M faz ilerlemesi 13 inhibitörü,DMSO içinde 30 uM konsantrasyonu. </li><li> Hücre inkübatör, tüm retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün. % 0.01 DMSO içinde 300 nM CDK1 / 2 inhibitörü III&#39;ün bir nihai konsantrasyonu elde retina ortamı doğrudan kimyasal reaktif ya da araç (DMSO), 10 ul ekle. El ile çözelti içinde kimyasal reaktif veya aracın eşit dağılımını sağlamak için 24 oyuklu plaka döndürün. </li><li> İstenen süre (en fazla 24 saat) süreyle% 5 CO2 ile bir inkübatör içinde 50 rpm sabit bir hızla, bir döndürücü çalkalayıcı üzerinde 37 ° C&#39;de retina eksplantlar inkübe edin. </li><li> 4. adıma geçin. </li></ol></li></ol> 4. Tespit ve Tüm Retina Eexplants dondurulması <ol><li> Hücre inkübatör tedavi bütün retina eksplant içeren 24 kuyu plakasını sökün. </li><li> 1 ml 1xPBS bölgesindeki / oyuk buz soğuğu% 4 paraformaldehid içeren bir 24-çukurlu plaka retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Incuba15 dakika süreyle buz üzerinde te. </li><li> Retina yıkamak için 1 ml / oyuk buz soğuğu 1xPBS ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 1 ml / 1xPBS iyi buz soğukluğunda% 30 sukroz ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bütün retinal eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. 1-3 saat retinanın embriyonik gün bağlı buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. ST20 için - ST25 (E3) retinalar, 1 saat süre ile inkübe edilir, daha eski retinalar sukroz uzun inkübasyon süresi gerekir. </li><li> Yaklaşık 500 ul kriyostat dondurma montaj orta içeren bir parafin film üzerine tüm retina eksplant aktarmak için küçük bir kaşık kullanın. Yavaşça küçük kaşık kullanarak dondurma ortamda retina eksplant hareket ettirerek kadar sakaroz mümkün olduğunca kaldırın. </li><li> Donma orta içeren bir gömme kalıp retina eksplant aktarın. Gelecekteki bölümlendirilmeleri kolaylaştırmak için göz yerleştirin. Dr üzerinde tüm retina eksplant içeren gömme kalıp koyunorta kadar y buz katı dondurulur. -80 ° C saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu çalışmada diseksiyon, elektroporasyon veya kimyasal arıtma ve tavuk embriyoları tüm retina eksplant kültür için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, hızlı, kolay ve hem de yüksek bir başarı oranı ve tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon söz konusu gen yapısını eksprese eden hücrelerin büyük bir kısmını oluşturur. Bu doğru elektrotları konumlandırmak için ve tanımlanmış bir DNA plazm...

Retina, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır ve göreli olarak basit ve iyi karakterize edilmiş hücre mimarisi, merkezi sinir sistemi gelişme eğitim için uygun bir model ile, bir. Tavuk embriyo göz embriyo geri kalanına kıyasla nispeten büyüktür. Bu nedenle bu tür enjeksiyonlar veya elektroporasyon gibi deneysel manipülasyonlar için ovo kolayca erişilebilir ve retina hücre ve in vivo gelişimsel biyoloji hakkında bilgi sahibi için mükemmel bir araç olarak hizmet vermektedir. Deneyler elektroporasyon, tekrar enjeksiyonları ya da kombine deneysel manipülasyonlar ile olduğu gibi invazif zaman bu büyük avantajlara rağmen, embriyoların sağkalım düşük olabilir. Ovo tavuk embriyo DNA plazmid Elektroporasyon önemli ve iyi bilinen bir tekniktir 1&#39;dir. Bu merkezi nerv hücre kaderinin yanı sıra nöronal yolları izleme, nöronların etiketlenmesi için izin verirlı sistemi ve in vivo proteinin fonksiyonunu analiz etmek için ektopik gen ifadesi için izin verir. Tekniğin 3 arka beyin ve 4 retina, nöral tüp 2 çalışmaları için kullanılmıştır. Ovo embriyonik retinanın Elektroporasyon in vivo durumla ilgili bazı deneysel zorlukları vardır. Embriyonun kranyal katlama nedeniyle göz konumu, kalpten nispeten yakındır. Bu yakınlık elektroporasyon aşağıdaki kardiyak arrest riskini ve embriyonun yaşla birlikte riski de artmaktadır. Ayrıca, göz erişmek için, bu suretle kanama, malformasyonlar ve sonraki azaltılmış canlılığı riskini artırarak, embriyonik zarlar açmak için gereklidir. Test ve bilinen bir fenotipik sonuç olmadan sık sık yeni bir DNA plazmid optimize ederken, bu sınırlamalar bile deneyimli bir deneye ilişkin yöntemin etkinliğini ve gücünü azaltabilir. Bu protokol, w kültüründe görüldüğü gibikaldırıldı pigment epiteli ile tüm nöral retina olarak tanımlanan deliğin retina eksplant, ovo yaklaşımda tamamlar verimli bir yöntemdir. Kimyasal reaktifler Göz içi enjeksiyonları ovo gerçekleştirmek için göreceli olarak kolaydır. Ancak, sinir retinada enjekte reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol etmek zor olabilir. Enjekte edilen hacim kaçak nedeniyle değişebilir ve enjeksiyon tam site gözün içindeki reaktif dağılımı ve vitreus yoluyla yayılmasını hem de etkileyebilir. Değişkenlik, yani bir enzim inhibitörü bir doz-yanıt eğrisi belirlenir sonuçların yorumlanması için önemli etkileri olacaktır; etkisi küçük ve etkisi zamansal pencere dar özellikle. Ovo deneylerde yaparken Üstelik, yalnızca tek göz, kan akışı yoluyla sistemik potansiyel etkilerine her embriyo kullanılabilirkontralateral gözün üzerine. Geliştirilmesi ve tedavi ve kontrol embriyolar ek deneysel değişkenliği yol açabilir arasındaki bireysel değişkenliği çalışılırken yaş eşleştirme önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, tavuk embriyolarından retina eksplantlar göre yöntem ovo eski bir nöral retinanın tekbiçimli maruz kalabilir ve in vitro deney koşullarını kontrol geliştirilmiştir. Mevcut protokol önceki protokollere 5-9 dayanarak geliştirilmiştir. Aşamasından Retina eksplantlar (st) st31 20 (3, embriyonik gün [E]) (E7) tavuk embriyoları kültürlendi, parçalara ayrıldı ve elektroporasyona tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonu veya bir kimyasal madde belirli bir konsantrasyonunu içeren bir ortama maruz bırakıldı. Burada sunulan protokol başarılı şekilde KU55933, SB 218078 ve NSC 109555 dito gibi DNA hasar yolağının regülatörleri de dahil olmak üzere, pek çok farklı kimyasal reaktif maddeler kullanılarak son yayınlarda uygulanmıştırBöyle CDK1 / 2 inhibitörü III 10,11 olarak mesilattır ve hücre döngüsü.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

Retina gelişen santral sinir sistemi için iyi bir modeldir. Ovo / in vivo deneysel manipülasyonlar için gözün büyük boy ve en önemlisi erişilebilirlik tavuk embriyonik retina çok yönlü ve çok verimli deneysel bir model yapar. Tavuk retina göz içi enjeksiyonlar veya elektroporasyon ile ovo hedef kolay olmasına rağmen, retinada reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol edilmesi zor olabilir. Bu göz veya maddelerin dengesiz difüzyon tam enjeksiyon yerinde, kaçak varyasyonları nedeniyle olabilir. Ayrıca, bu tür elektroporasyon gibi invaziv manipülasyonlara sonra malformasyonlar ve ölüm sıklığı oldukça yüksektir. Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantlar kültürlenmesi için tekniğin ovo bir eski açıklar ve reaktifler retinanın kontrol maruz için bir yöntem sağlar. Protocol deneysel, incelemek işlemek ve tavuk embriyoları kültür bütün retina eksplantlar açıklamaktadır. Eksplantlar, yaklaşık 24 saat boyunca kültüre edilebilir ve elektroporasyon gibi farklı manipülasyonlara tabi. Önemli avantajları Deney embriyo hayatta kalma ve katılan reaktif maddenin konsantrasyonu değişebilir ve etkili konsantrasyonunu tespit etmek ve optimize etmek için kontrol edilebilir bağımlı değildir vardır. Ayrıca, teknik, yüksek deneysel bir başarı oranı ile birlikte, hızlı, ucuz ve, bu tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. O ovo yapılan deneyler için mükemmel bir tamamlayıcı olarak hizmet ettiği vurgulanmalıdır.

Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantların preparasyonu (Şekil 1A-F) kültürlenmesini tarif eder. Bu protokol, başarılı bir şekilde st31 için ST20 (E3) embriyolardan tam retina eksplantlar (E7) kullanılmaktadır. Bütün retina eksplantlar, DNA plazmidleri Elektroporasyon retina progenitör hücrelerin etiketlenmesi ve izleme ya da aşırı ifadesi, farklı gen ürünlerinin sağlar. Elektroporasyon deneyleri için, pigment epitel dikkatle ST2...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.

Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Görüntüleme.  Uppsala University.  Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır. 

Video: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

ChickGFP Nöral Tüp Greftleme ve Karbosiyanine Boya DiI Enjeksiyonu Kullanılarak Tavuk Embriyoları İçinde Nöral Kret Hücrelerinin ve Kan Damarlarının Çift Etiketlenimi

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...