Yaş, enfeksiyon ve ototoksik ilaçlar, iç kulağın saç hücrelerinin dejenerasyonuna neden olabilir ve bu da içimizde işitme kaybına neden olur. Civciv gibi memeli olmayan omurgalılarda, saç hücreleri rejenere edilebilir. Burada açıklanan teknikler, civciv embriyoları üzerinde çalışmanın maliyet etkinliğinden, embriyo elde etme kolaylığından ve doku eksplantlarının iyi bir exo gelişiminden yararlanmaktadır.
Kuş iç kulak kıllarının gelişimini ve yenilenmesini anlamak, işitme kaybı ve potansiyel tedaviler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir ve eksplant kültürü, çeşitli ilaçların ototoksik etkilerini değerlendirmek için önemli olabilir. Deneye başlamadan önce, taze yumurtlanmış yumurtaları tedarik edin ve kontaminasyonu önlemek için% 70 etanol ile temizleyin. Yumurtaları 3,5 ila 4 gün boyunca,% 45 nem oranıyla 37 ila 38 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, embriyoyu beş dakika boyunca yan tarafına bir yumurta yerleştirerek yumurta sarısının tepesine yeniden yerleştirin. Ardından, 21 gauge iğnenin geçmesi için yumurtanın üstünde ve kör ucunda küçük bir delik açmak için forseps kullanın. Beş mililitrelik bir şırınga ve 21 gauge iğne kullanarak, albüminin iki mililitresini yumurtanın kör ucundaki bir delikten çıkarın.
Şeffaf bant kullanarak künt uçtaki deliği örtün. Yumurta penceresini yapmak için şeffaf bandı yumurta kabuğunun üstüne yapıştırın. İğneleri dikey pipet çektirme makinesi kullanarak standart cam kılcal damarlardan mikroenjeksiyondan tutun.
Çektikten sonra, konik bir uçla yaklaşık 50 mikrometrelik bir uç çapı elde etmek için ince forseps kullanarak kılcal ucu kırın. Gen nakavt deneyi için, kılavuz plazmid, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP olmak üzere üç yapıyı, bir mikrogram SP Cas9 proteini,% 30 sakkaroz ve% 0.1 hızlı yeşil boya ve 10 mikrolitrelik bir son hacim ile bire bir oranında karıştırın. Birden fazla plazmidi elektroporize ederken, DNA'nın nihai konsantrasyonunun mikrolitre başına en az dört mikrogram olduğundan emin olun.
Yay yayı yardımıyla makas iki santimetre uzunluğunda ve 1,5 santimetre genişliğinde bir pencereyi keser ve embriyoyu açığa çıkarır. Daha sonra embriyonun üzerindeki koryonik zarları açmak için forseps kullanın ve embriyoya erişime izin verin. Otik vezikülü doldurmak için yaklaşık 200 nanolitre hacimli DNA çözeltisi karışımı enjekte edin.
Kılavuz RNA verimliliğini belirlemek için bir T7 endonükleaz testi yapın. Elektrik direncini düşürmek ve aşırı ısınmayı önlemek için embriyoya% 0.719 salin damlası ekleyin. Daha sonra, pozitif elektrodu yumurtanın künt tarafında yapılan delikten yerleştirin ve elektrodu yumurta sarısının altında olacak şekilde manevra yapın.
Negatif elektrodu doldurulmuş otokistin üzerine yerleştirin. Plazmidi elektroporasyon ile otik veziküle aktarmak için, bir kare darbe jeneratörü kullanın ve her biri 50 milisaniye arayla 100 milisaniye boyunca 25 voltluk beş darbe uygulayın. Bireysel bir elektroporasyon kurulumuna dayanarak koşulları ampirik olarak belirleyin.
Elektroporasyondan sonra, birkaç damla% 0.719 salin ekleyerek embriyoyu nemlendirin. Yumurtayı şeffaf bantla tekrar kapatın ve daha fazla inkübasyon için nemlendirilmiş inkübatöre 37 ila 38 santigrat derecede geri dönün. Cerrahi masayı, mikroskop aşamasını ve çevresini% 70 etanol ve ısı kullanarak dezenfekte edin veya alkol, minimal yaylı makas, mikro kürek ve iki çift ince forseps dahil olmak üzere mikro diseksiyon ekipmanını sterilize edin.
Siyah silikon tabanlı bir cam Petri kabı, 90 milimetre plastik Petri kabı ve 60 milimetre Petri kabı içeren diseksiyon plakalarını hazırlayın. HBSS olarak da bilinen soğutulmuş PBS veya Hanks'in dengeli tuz çözeltisini diseksiyonlara hazır tutun. Yumurtayı yavaşça 90 milimetrelik Petri kabına kırın.
Ardından civcivin dış kulağını tanımlayın ve kafayı buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, embriyoyu gaganın üst kısmı içeriye bakacak şekilde yönlendirin ve beş numaralı forsepslerden birini kullanarak gagayı tutun. İkinci beş numaralı forseps kullanarak gözleri kepçeyle çıkarın.
Daha sonra, rostralden kaudal'a, kafatasını orta çizgisi boyunca kesin ve beyni çıkarın. Daha fazla buz gibi PBS veya HBSS ekleyin ve lagenanın iki otolitini koklear kanalın sonunda ve orta çizgiye yakın parlak yapılar olarak bulun. İki iç kulağı izole etmek için, iki lagena arasında ve bölgenin çok üstünde ve altında kesin.
Daha sonra eğik aydınlatma altında iç kulağın ana hatlarını görselleştirin ve yabancı dokuyu ve girişi çıkarın. İzole kokleanı buz gibi soğuk PBS'li siyah silikon taban plakasına aktarın. Koklear kanalı elde etmek için beş numaralı forseps kullanarak kıkırdaklı koklear kapsülü soyun.
Daha sonra koklear kanalın dalgalı tabakasını veya tegmentumunu bulun ve baziler papillayı veya BP'yi açığa çıkarmak için 55 numaralı forseps kullanarak çıkarın. Daha sonra, 55 numaralı forseps kullanarak saç hücrelerini ve destekleyici hücreleri ortaya çıkarmak için tektoryal zarı çıkarın. Baziller papillanın membran kültürü için, altı kuyucuklu bir doku kültürü plakası alın ve kuyucuk başına bir kültür membran eki yerleştirin. 200 mikrolitrelik bir pipet içinde bir miktar ortam hazırlayın ve ardından disseke edilmiş baziler papilla eksplantını bir X HBSS tamponu ile aspire edin.
Eksplantı bir zar üzerine aktarın ve baziler papilla yukarı bakacak ve saç ve destek hücreleri üstten görülebilecek şekilde yönlendirin. Eksplant yerleştirildikten sonra, HBSS tamponunu kültür membranı yüzeyinden yavaşça aspire edin. Bu işlemde eksplant kültür membranına bağlanacaktır.
Membran eki ile kuyu duvarı arasına 1,2 mililitre dulbecco'nun modifiye kartal ortamı veya DMEM kültür ortamı ekleyerek altı kuyu plakasının kuyusunu doldurun. Koklear kanalın kollajen kültürünü hazırlamak için, dört kuyucuklu bir plakanın her bir oluğuna üç damla taze hazırlanmış kolajen karışımı ekleyin ve disseke koklear kanalı her bir kollajen damlasına aktarın. Kollajen matrisini iyileştirmek için plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika ve % 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Kültürlerin küçük moleküllü bir tedavisi için, kültür ortamını penisilin gibi farmakolojik modülatör ile desteklenmiş 700 mikrolitre ortam ile değiştirin ve plakaları daha önce gösterildiği gibi inkübe edin. Kültür medyasının %50'sini her gün değiştirin. Uygun inkübasyon süresinden sonra, kültür ortamını çıkarın ve eksplantları aşağı akış analizleri için kullanın.
Elektroporasyon kurulumunda doğru elektrot konumlandırması, her iki vestibüler organda iç kulakta daha yüksek GFP ekspresyonu ve transfeksiyonu doğrulayan işitsel baziler papilla ile sonuçlandı. CRISPR Cas9, iç kulakta Atoh1 gen nakavtına aracılık ederek saç hücrelerinin kaybına neden oldu. Bir ovo-elektroporasyon yoluyla Atoh1 gen nakavtının ardından E10'a kadar inkübasyon, boş plazmid kontrolüne kıyasla saç hücresi gelişiminin azaldığını gösterdi.
Elektroporasyon mozaik olmasına rağmen, kontrol elektroporat hücreleri saç hücrelerini oluşturabilmiştir. Atoh1 gRNA elektroporatörlü örneklerde, yeşil floresan protein pozitif hücreler hiçbir zaman saç hücresi gelişiminin belirteçlerini göstermedi. Baziller papillanın 3D matriksteki organ kültürü, örneğin saç hücresi antijenine karşı antikorlarla kollajen ve leke, doku morfolojisinin beş güne kadar mükemmel bir şekilde korunmasını sağlamıştır.
Saç hücrelerinin ve destekleyici hücrelerin organizasyonu bu kültür koşullarında korunmuştur. Bir zar üzerindeki organ kültürleri, saç demeti bütünlüğünü korurken beş güne kadar korunabilir. Bu, temsili görüntüde, uç bağlantı proteini protocadherin 15'in lokalizasyonu ile görülebilir.
Saç demetinin gelişimini araştırmak için, süper çözünürlüklü mikroskopi veya taramalı elektron mikroskobu gibi daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme daha fazla bilgi sağlayabilir. İşlem boyunca steril koşullar korunmalıdır. Elektropozlama yaparken, embriyoların kurumadığından emin olun.
Farmakolojik inhibitörleri titre ederken, herhangi bir öldürücülüğün üstesinden gelmek için konsantrasyonu azaltabilir. Görüntüleme deneyleri için hem embriyolar hem de eksplantlar alınabilir. Protokolde gösterildiği gibi gerçek zamanlı video mikroskobu veya statik ışık konfokal elektron mikroskobu gerçekleştirerek.
Civciv iç kulak eksplantlarını kullanmanın kolaylığı ve erişilebilirliği göz önüne alındığında, saç hücresi yenilenmesi için gerekli olan yeni molekülleri tanımlamak için kanıt taraması yoluyla ortamı kullanabiliriz.
