Bu protokol, birincil fare retinal pigmentli epitel hücrelerini başarılı bir şekilde izole etmenin kolay ve etkili bir yolunu özetleyecektir. Retina pigmentli epitel hücreleri, fotoreseptör hücrelerin korunmasında ve retinanın normal fonksiyonunun sağlanmasında çok önemli bir rol oynar. Laboratuvarımız primer fare pigmentli epitel hücrelerini, dış kan-retina bariyerini ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi ilgili hastalıkları incelemek için önemli bir araç olarak izole etmektedir.
Fare gözlerini çıkarmak için, fareyi kurumunuzun onaylı yöntemlerine göre etik olarak ötenazi yapın, ardından fareyi steril bir alt tabana yerleştirin ve proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı bir cımbız basarak gözü çekirdeklendirin, ardından cımbızı gözün arkasına doğru hareket ettirin ve optik sinirin hala sağlam olmasını sağlamak için gözü çıkarmak için yavaşça çekin. Forseps kullanırken, gözleri% 5 povidon iyot içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika kuluçkaya yatırın.
Gözleri povidon iyottan çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanırken, povidon iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri Hanks'Balanced Saline Solution ile yıkayın. Bu yaklaşık 2 ila 3 yıkama gerektirir.
Gözleri yeni bir Petri kabına yerleştirin ve soğuk tam RPE hücre büyüme ortamına batırın. Oradan, diseksiyon mikroskobu altında diseksiyona başlayabilirsiniz. Mikroskop altında, ekstraoküler kaslardaki bağ dokusunu çekmek veya kesmek için cımbız ve / veya Vannas makası kullanın.
Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında bir saat tutulabilir. Ancak göz küresini temizledikten sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir. Gözleri, A enzimi çözeltisini içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, ardından gözleri 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içinde inkübe edin.
Gözleri A enzimi çözeltisinden çıkarın ve B enzimi çözeltisini içeren yeni bir 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, ardından bir inkübatörün içine yerleştirin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gözleri B enziminden çıkarın ve 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve batırın ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlayın, ardından gözleri 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.
Ora seratta bölümünde bir kesi yapmak için M5S forseps ve bir şırınga iğnesi kullanın. Şimdi iki forseps ile, bir forseps ile insizyonun iç kısmını kavrayın ve korneayı diğer forseple kavrayın. Korneayı çekerek retinadan yavaşça yırtmaya başlayın.
Küçük artışlarla yırttığınızdan ve korneayı çıkarırken yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun. Bu, RPE'nin çoğunlukla bozulmadan kalmasını ve daha temiz bir gözyaşı elde etmenizi sağlayacaktır. Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lensi görebilmelisiniz.
İzolasyonun saflığını korumak için hem irisi hem de lensi forseps ile çıkarın. Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbızın bir kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle uzaklaştırın, ardından nöral retinayı atın.
RPE katmanını tabakta döküntü içermeyen farklı bir yere taşıyın. RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı bir cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri askıya alındığında bulutlu görünür ve RPE hücresi büyüme ortamını tamamlar.
3,2 mililitrelik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreler oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'da santrifüj edilebilir. Daha sonra süpernatantı aspire edebilir ve peleti ısıtılmış RPE hücre büyüme ortamında yeniden askıya alabilirsiniz.
Hücreleri 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. Bu görüntüler, RPE hücrelerinin pigmentasyonu ile belirgin olan pasaj 0 ve pasaj 1'de başarılı bir izolasyon göstermektedir. 4. pasajda, hücreler daha az karakteristik hale gelir ve daha az pigment sergiler, iğ benzeri bir görünüm gösterir veya daha geniş bir yüzey alanı ile daha sağlam hale gelir.
RPE hücrelerini RPE'ye özgü bir belirteç, RPE65 ve bir sitoiskelet proteini F-aktin ile doğruladık. Ayrıca, Muller hücresine özgü bir belirteç olan vimentin ile boyayarak Muller hücreleri ile potansiyel kontaminasyonu kontrol ettik. Bu protokol, mevcut protokollerin basitleştirilmiş bir uyarlamasıdır.
Protokol, çoğu araştırma laboratuvarında bulunan ve birincil fare RPE hücrelerinin etkili bir şekilde izole edilmesine yardımcı olacak malzemeleri ve ilgili ekipmanları kullanır.
