Retina pigment epiteli veya RPE, retina sağlığı için kritik öneme sahiptir. İzole RPE'nin incelenmesi retina hastalığı için çok önemlidir. Popüler bir miyopi modeli olan kobaydan RPE izolasyonunun bu yöntemi, zorlu problemin çözülmesine yardımcı olur.
Bu tekniğin temel avantajı, nispeten basit olması ve RPE analizi de dahil olmak üzere biyolojik moleküler çalışmalara uygun yüksek kaliteli RPE örneği vermesidir. Gösterilen tekniği mükemmel bir şekilde takip ederek ve diseksiyon araçlarının nasıl manipüle edileceğini gözlemleyerek, bu prosedürde bazı uygulamalarla hızlı bir şekilde ustalaşabilirsiniz. Gine domuzu insancıl bir şekilde ötenazi yaptıktan ve hayvanın gözlerini çekirdeklendirdikten sonra, gözleri derhal steril fosfat tamponlu salin veya PBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına aktararak yıkayın.
Yıkadıktan sonra, gözleri taze PBS çözeltisine aktarın. Şimdi diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, bir gözün sklerasında, kornea ve sklera arasındaki limbal sınırın yaklaşık bir milimetre arkasında ilk küçük bir açıklık yapmak için 18 gauge iğne kullanın. Makas kullanarak, kornea, iris, siliyer gövde ve kristalin lens dahil olmak üzere ön segmenti çıkarın.
Daha sonra kalan bir posterior oküler segment ile çalışarak, Zinn zonulünü kavramak ve nazikçe çekmek için forseps kullanın, ardından retinayı RPE / koroid / sklera kompleksinden ayırın ve retinayı parçalanmadan soyun. Retina tamamen çıkarıldıktan sonra, RPE, koroid ve sklerayı içeren kalan arka göz kabını, iki mililitre doku depolama reaktifi içeren 12 delikli bir plakanın kuyucuklarından birine daldırın ve beş dakika boyunca daldırın. Depolama reaktifini durulamak için, vizör kabını iki mililitre PBS ile doldurulmuş üçüncü bir kuyucuğa taşımadan önce 10 saniye boyunca dört mililitre PBS ile doldurulmuş başka bir kuyucuğa aktarın.
Son RPE izolasyon adımına geçmeden önce, PBS ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırınga hazırlayın ve 30 gauge iğne takın. PBS jet akımı oluşturmak için şırınga pistonunu yavaşça itin. Bir mikroskop altında çalışarak, ilk olarak, RPE'deki bu PBS akışını, içinde küçük bir yırtık veya delik açmak için hedefleyin.
Ardından, RPE'yi koroidden bir tabaka olarak ayırmak için PBS akışını oluşturulan açıklığa yönlendirin. RPE'yi koroidden ayırdıktan sonra, RPE hücrelerini iğnesiz bir mililitrelik şırıngada toplayın ve toplanan numuneyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bir RPE peleti elde etmek için tüpü toplanan RPE ile 8.000 x g'de bir dakika boyunca santrifüj edin.
RNA analizlerinde kullanılacak numuneler için, süpernatanı, yani PBS çözeltisini atın ve RNA izolasyon kitlerine dahil edilen 350 mililitre lizis tamponu ile değiştirin. İyice karıştırmak ve numunenin kalitesini korumak için içeriği 20 kez yukarı ve aşağı borulayın. Uzun süreli depolama ve koruma için, numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarın.
Bir RNA izolasyon kiti kullanın ve elektroforez yoluyla numunenin kalitesini değerlendirmeden önce RNA'yı RPE numunelerinden izole etmek ve toplamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Çalışmamızda, toplanan RPE örnekleri, RNA bütünlük numarasına veya sekizden büyük RIN'ye sahip iyi korunmuş RNA gösterdi. Toplam RNA sayısı göz başına yaklaşık 240 nanogramdır.
RPE spesifik gen olan Rpe65'in ekspresyon seviyesi, RPE örneklerinde koroid ve skleraya göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Buna karşılık, RPE örnekleri, izole RPE örneklerinde koroidal ve skleral kirleticilerin bulunmadığını gösteren seçilmiş koroid sklera spesifik genin, kollajen tip alfa-bir'in minimal ekspresyonunu gösterdi. İşlemin en önemli adımı, retinanın geride herhangi bir retina parçası bırakmadan düzgün bir şekilde çıkarılmasıdır.
Bu RPE izolasyon prosedürü, in vitro hücre kültürü çalışmalarını, izolasyondan sonra RPE hücrelerini daldırmak için ortam seçimi de dahil olmak üzere bazı önemli farklılıklarla açıklamayı garanti eder.
