Protokolümüz multimodal, doğrusal olmayan, optik bir mikroskopi sunar ve kanser hücrelerinde altın nanopartiküllerin kimyasal olarak spesifik görüntülemesini gerçekleştirmek için uygular. Görüntüleme sistemimizin temel avantajı, hücresel yapıların ve altın nanopartiküllerin biyomoleküler kontrastını multimodal bir şekilde gözden geçirmek için kullanılabilmesidir. Başlamak için, uzaktan kumanda kutusu hariç tüm ekipmanların fişlerini açın.
Ardından, kutunun arkasını açın ve kontrol kutusundaki uzak ışık mavi yandıktan sonra İşlemi Başlat'a basın. Daha sonra, lazer tarama mikroskobunun PC'sini açın ve konfokal mikroskop yazılımını çalıştırın. Ardından, bilgisayar yazılımını kullanarak mikroskopun ışık yolunu kontrol edin ve odağı dokunmatik ekrandan veya uzaktan kumanda düğmelerinden veya bilgisayar yazılımından kontrol edin.
Yakınlaştırma, piksel cinsinden Görüntü Boyutu ve piksel bekleme süresi dahil olmak üzere yazılımda istediğiniz görüntü ayarlarını seçin ve pikselin bekleme süresinin entegrasyon süresinden daha büyük olmasını sağlayın. Lazer ışınlarını numuneye odaklayan suya daldırma hedefinin üzerine ve görüntüleme için kondenser ile numune arasına bir damla damıtılmış su damlacığı yerleştirin. Ardından, maksimum ışık miktarını toplamak için kondenserin yüksekliğini numunenin yaklaşık bir milimetre yukarısına ayarlayın ve hareketli bir montaj üzerine yerleştirilen SRS dedektörünü beyaz ışık kullanarak numuneye odaklanmak için ışın yolundan dışarı doğru hareket ettirin.
Yazılım ayarlarını kullanarak, pompa ışınını seçin ve lazer dalga boyunu CH titreşimleri için 802 nanometre ve amid I zirvesi için 898 nanometre olarak değiştirin ve Raman kaymasındaki büyük değişiklikleri hesaba katın. Raman kaymasında küçük ayarlamalar yapmak için, SFTRU birimindeki gecikme aşamasını makalede açıklandığı gibi tarayın. Hiperspektral veri kümesi için Tetikleyici sekmesini seçin, ttl tetikleyicisiyle başlat'a tıklayın ve ardından Her kareyi tetikle'yi seçin.
Ardından, Seri sekmesinde, zaman serisini açık ve Z serisini kapalı olarak ayarlayın. Ayrıca, zaman serisindeki kare sayısını ATM yazılımındaki adım sayısıyla eşleşecek şekilde ayarlayın. Ardından, ATM yazılımındaki Çalıştır sekmesine gidin ve CH için gecikme aşaması konumlarını 90.25 ve 92.25 olarak ayarlarken, amide I bölgesi için hiperspektral taramanın başlatma ve durdurma konumuna karşılık gelen 89 ve 91 milimetre olarak, adım sayısının bilgisayar yazılımındaki kare sayısıyla eşleşmesini sağlayın.
Doğru ayarları kontrol ettikten sonra, önce Al'a gidip ardından Taramayı başlat'a tıklayarak bilgisayar yazılımındaki hiperspektral yığını başlatın. Ardından, ATM yazılımında, seçilen başlangıç ve bitiş konumları arasındaki gecikme aşaması konumunda artımlı artışlarla bir dizi görüntünün toplanmasını başlatan Başlat'a tıklayın. Ardından, hiperspektral bir tarama oluşturmak için farklı gecikme aşaması konumlarında bir dizi görüntü alın.
Analog üniteyi kullanarak, görüntü alımını ve gecikme aşamasının hareketini senkronize etmek için SFTRU sistemine ttl sinyalleri gönderin ve alın. CH titreşim bölgesindeki görüntüleme ile amid I titreşim bölgesi arasında geçiş yapmak için, lazer yazılımındaki pompa dalga boyunu 802 nanometreden 898 nanometreye değiştirin. Ayrıca, ATM yazılımındaki Stokes dağılım ayarını 30 milimetreden 5 milimetreye değiştirin.
SFTRU kutusunun içindeki pompa ışını dağılım yolundaki aynaya küçük bir ayar yapmak için ayna yuvasındaki alt düğmeyi ayarlayarak ayna açısını artımlı bir miktarla değiştirin. Polistiren mikrosferlerinin kimyasal seçiciliğini doğrulamak için, hiperspektral uyarılmış Raman saçılması ve spontan Raman spektrumları kaydedildi. Spektrumlar, göreceli yoğunlukta gözlenen fark dışında aynıydı.
4T1 kanser hücrelerinin uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi, lipid, protein ve DNA biyomoleküllerinin karbon-hidrojen germe titreşim bandına karşılık gelen 2, 852, 2, 930 ve 2.968 dalga numaralarında gerçekleştirildi. Kanser hücrelerindeki nanopartikül dağılımlarını araştırmak için altın nanopartiküllerle dozlanan 4T1 kanser hücrelerinin multimodal görüntülemesi yapıldı. CH2 ve CH3 kanalı, LysoTracker floresan probları ve rezonans dışı uyarılmış Raman saçılma kanalı için elde edilen uyarılmış Raman saçılma görüntüleri elde edildi.
Hatırlanması gereken en önemli şey, lazer yazılımındaki titreşim bölgesini, pompa referansını ve ayrıca protokol sırasında Stokes dağılım ayarını değiştirmektir. Bu sistem, optik hizalamayı etkilemeden femtosaniyeden pikosaniye bölgesine kolayca değiştirilebilir. Bu yetenek, çoklu foton tutarlı Raman saçılması ve pompa probu spektroskopisi ve uygulamalarını gerçekleştirmemizi sağlar.
Bu multimodal görüntüleme platformu, nanotıp hakkında yeni bilgiler sağlar ve hücrelerin, dokuların ve altın nanopartiküllerin moleküler olarak görüntülenmesinin yolunu açar.
