İntraoperatif cerrahi monitör analizi, tümör rezeksiyon ameliyatlarında hala büyük bir zorluktur, çünkü kanserli dokunun karmaşık eksizyonunu doğru ve hızlı bir şekilde doğrulamak için bir tanı aracı gerektirir. Daha sonra pozitif bir cerrahi marj nedeniyle tekrarlanan ameliyatlardan kaçınmak mümkündür. Yüksek hızlı üstü açık ultraviyole fotoakustik mikroskopimiz, beş ila beş milimetre karelik bir görüntüleme alanıyla 18 dakika içinde doku örneklerinin etiketli histolojik görüntülerini sağlayabilir ve bu da intraoperatif cerrahi marj analizi için büyük potansiyel gösterir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan son sınıf doktora öğrencisi Xiufeng Li olacak. Uyarma kaynağı olarak 266 nanometre dalga boyuna sahip bir Q-anahtarı diyot pompalı katı hal lazeri kullanarak mikroskobik sistem için optik aydınlatmayı ayarlayarak başlayın. Lazer ışınını genişletmek için iki dışbükey lens takın ve uzamsal filtreleme için ilk dışbükey lensin odak noktasına yakın bir iğne deliği yerleştirin.
Lazer ışınını yukarı doğru yansıtmak için 1D galvanometre aynası kullanın. Objektif lensin yardımıyla, lazer ışınını bir numuneye odaklayın. Halka şeklindeki odaklanmış UT'yi, aktif alan yukarı bakacak şekilde, altta ince bir kuvars kapak kayması ile kaplanmış optik olarak şeffaf bir pencereye sahip laboratuar yapımı bir su deposuna sabitleyin, ardından UT'nin yanal konumunu kontrol etmek için su deposunu mikroskobun iki eksenli manuel aşamasına takın. İşiniz bittiğinde, UV lazerini açın ve lazer ışınının UT'nin merkezinden geçmesine izin vermek için UT'nin konumunu ayarlayın, ardından UV lazerini kapatın ve UT'yi tamamen batırmak için su deposunu deiyonize suyla doldurun. Toplam 56 desibel kazanç elde etmek için UT'nin çıkışını iki amplifikatöre bağlayın ve ardından ikinci amplifikatörün çıkışını bilgisayarda yüklü bir veri toplama kartına veya DAQ'ya bağlayın.
Daha sonra, xy motorlu aşamalara bağlı bir z ekseni manuel aşamasına bir numune tutucu takın ve ardından numune tutucunun boş deliğini çevreleyen dört parça çift taraflı bant yerleştirin. Daha sonra, siyah bandı bir cam slayta takarak ve ardından cam sürgüyü numune tutucunun deliğini siyah bant aşağı bakacak şekilde kaplayacak şekilde yerleştirerek sistemi hizalamaya devam edin. Numune tutucu üzerindeki cam kaydırağa bastıktan sonra, cam sürgüyü suya batırmak için numune tutucuyu indirin.
Halka şeklindeki UT ve amplifikatörlerin bağlantısını kesin, ardından UT'yi pulser/alıcıya ve pulser/alıcının çıkışını bir osiloskopa bağlayın. Darbeyi/alıcıyı, darbe genliği altı ve kazanç 20 desibel olan darbe yankısı modunda çalıştırın. Parametreler ayarlandıktan sonra, numune tutucunun z-konumunu ayarlayın, ultrasonik sinyallerin maksimum olduğu akustik odak düzleminin konumunu tanımlayın.
Kazancı 60 desibel'e ayarlamadan önce darbeyi/alıcıyı iletim moduna getirin, ardından lazer çıkışını etkinleştirin ve osiloskop tarafından ölçülen fotoakustik veya PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için objektif lensin z-konumunu ayarlayın. Üretilen PA sinyalini simetrik ve maksimum yapmak için, halka şeklindeki UT'nin yanal konumunu ayarlayın, ardından PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için numune tutucunun z konumunu ayarlayın. PA sinyallerinin simetrisini ve genliğini optimize etmek için objektif lensin ve numune tutucunun z-konumu için ayarlamaları tekrarlayın.
PA sinyalleri optimize edildiğinde, zaman gecikmesini veya PA dalgalarının osiloskoptaki UT'ye ulaşmak için harcadığı süreyi kaydedin. Siyah bandın farklı konumlarını görüntülemek için numune tutucuyu hareket ettirin. Numune tutucuların düzlüğünü, siyah bandın her bir konumundan üretilen PA sinyalleri daha önce ölçülenle aynı zaman gecikmesine sahip olacak şekilde ayarlayın.
Sistem hizalaması tamamlandıktan sonra, lazeri kapatın ve UT'yi iki amplifikatöre bağlayın. Formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü bir fare beyin dilimi hazırlamak için, hasat edilen beyni% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. 24 saat sonra, sabit beyni derecelendirilmiş alkolle dehidrasyon, ksilen ile temizleme ve parafin ile gömme yoluyla işleyin.
Gömülü beynin beş mikrometre kalınlığında dilimlerini elde etmek için bir mikrotom kullanın. Numune dilimlerini kuvars slaytlarının üzerine yerleştirin ve bir saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırında kurutun. Daha sonra, parafinin yüksek arka plan sinyallerini önlemek için beyin bölümlerini bir temizleme maddesi ile parafin de-paraffinize edin.
Taze bir fare beyin dilimi hazırlamak için, hasat edilen fare beynini PBS ile yıkayın ve ardından beyin örneğinin beş milimetre kalınlığındaki bir dilimini elle kesin, ardından enine kesitteki kanı çıkarmak için beyin dilimini PBS ile yıkayın. Numune yerleştirme için, 10 mikrometre kalınlığında UV şeffaf polietilen membranlı laboratuvar yapımı bir numune tankı hazırlayın, ardından membrana bir damla su ekleyin ve biyolojik numuneyi suyu örtmek için numune tankına yerleştirin. Ardından, numune içeren tankı, numune tutucunun boş deliğini kapatacak şekilde numune tutucunun üzerine yerleştirin.
UV lazeri harici tetik moduna ayarlayın ve tarama parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlamak için laboratuarda oluşturulan laboratuvar görünümü programını kullanın. X ve y eksenli motorların hareketli adım sayısını ayarlayarak küçük bir bölgede deneme taramasını başlatın, ardından maksimum PA sinyalleri elde etmek için numuneyi odak düzlemine yerleştirmek üzere z ekseni manuel aşamasını ayarlayın. Hem x hem de y eksenli motorları istenilen başlangıç noktasına taşıdıktan ve xn ve yn değerlerini ayarlayarak tarama bölgesini ayarladıktan sonra görüntü alma programını başlatın.
Görüntüler gerektiğinde, lazeri kapatın ve numune tutucuyu çıkarın. Taze biyolojik dokuları% 10 nötr tamponlu formalin içinde saklayın. Laboratuvarda oluşturulan bir görüntü işleme algoritmasının yardımıyla maksimum genlikli projeksiyon görüntüsünü yeniden oluşturmak için toplanan PA sinyallerini kullanın.
Temsili analiz, bir FFPE fare beyin diliminin UV-PAM ve H&E görüntülerini gösterir. Yakınlaştırılmış UV-PAM görüntüsünde, tek tek hücre çekirdekleri çözülebilir. Karşılık gelen hücre çekirdekleri, standart H & E boyalı görüntülerde bulundu ve hücresel görüntüleme için mevcut sistemin yüksek doğruluğunu gösterdi.
Gri tonlamalı UV-PAM görüntüsünü sanal bir H&E boyalı görüntüye aktarmak için derin öğrenme algoritması uygulandı. UV ışığının sistem hizalaması sırasında bir merkezden geçmesine izin vermek için halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün konumunu ayarlamak önemlidir. Bu, algılanabilir bir fotoakustik sinyalin elde edilebilmesini ve lazer açıkken daha da optimize edilmesini sağlar.
Sınıflandırma algoritmamız, görüntülerdeki tümörü ve normal bölgeleri sınıflandırmak için daha da dahil edilebilir ve tıp uzmanları için yardımcı bir görüntüleme ve tanı platformu olarak hizmet eder.
